双歧杆菌载带Ghrelin基因治疗急性放射性肠损伤研究杨业鹏1梁莉2.DOCVIP

双歧杆菌载带Ghrelin基因治疗急性放射性肠损伤研究 杨业鹏1 梁莉2 刘建智1 周梅1 李载权1 张照辉2 1北京大学基础医学院放射医学教研室 北京 100191； 2北京大学第三医院肿瘤化疗与放射病科 北京 100191 本研究构建携带脑肠肽Ghrelin编码基因的原核表达质粒，将其转化双歧杆菌，观察重组菌株在体外培养条件下表达、分泌Ghrelin蛋白情况以及给予小鼠灌胃处理后该重组菌株对小鼠急性放射性肠损伤的预防治疗作用，探索以双歧杆菌为基因递送载体的放射损伤预防与治疗新方法。 依据Genbank中公布的Ghrelin基因序列信息，设计特异引物，以人胃癌细胞提取总RNA为模板，经RT-PCR扩增出Ghrelin基因片段。以双歧杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pCMB1为构架，插入目的基因Ghrelin，成功构建pCMB1-Ghrelin质粒，以电穿孔法转化长双歧杆菌 NCC2705，获得了重组双歧杆菌菌株。用RT-PCR和ELISA法检测重组菌株中Ghrelin基因在mRNA水平和蛋白质水平的表达情况。选用三级（SPF级）ICR雄性小鼠118只，分为7组（正常对照组22只，其余各组每组16只）。除正常对照组外，各组小鼠麻醉后，行60Coγ射线一次性全腹部局部照射，剂量：9.0Gy。正常对照组，第0天开始PBS灌胃；单纯照射组，照射后第0天开始PBS灌胃；未转化菌预防组、重组菌预防组，于照射前3天开始，分别用未转化和重组双歧杆菌灌胃；未转化菌治疗组、重组菌治疗组，于照射后第0天开始，分别用未转化和重组双歧杆菌灌胃；各组均为每3天灌胃1次；Ghrelin注射对照组，于照射后第0天开始尾静脉注射Ghrelin蛋白溶液，每2天注射一次。观察照射后动物一般状况，体重、存活、便潜血等情况。于照射后0、1、3、6、10天收集小鼠粪便，用PCR和ELISA法检测粪便中双歧杆菌NCC 2705特异基因序列、Ghrelin基因片段和Ghrelin蛋白含量。小鼠于照射后3天、10天分批断头取血，用ELISA和高效液相色谱法分别检测小鼠血中Ghrelin蛋白和功能片段含量；用ELISA法检测血中内毒素、D-乳酸和二胺氧化酶含量，反应小鼠肠屏障功能变化；用ELISA法检测血中TNF-α和IL-6含量，反应小鼠炎性指标变化。照射后第3天，取小肠组织制备病理切片，以HE和TUNEL染色，观察小肠组织病理改变和小肠上皮细胞凋亡情况。 结果显示，重组双歧杆菌菌株在体外培养条件下能够在mRNA水平和蛋白质水平稳定表达Ghrelin，在各个培养时间点上，培养液上清内的Ghrelin含量均显著高于细菌胞内的Ghrelin含量，提示重组双歧杆菌株表达的Ghrelin为分泌型。 给予小鼠灌胃处理后，重组双歧杆菌菌株可以在小鼠肠道内定植并持续增殖，可在肠道中持续表达Ghrelin蛋白，表达蛋白可被吸收进入小鼠体内。重组双歧杆菌灌胃，可以有效改善射线造成的肠道病理改变，降低小鼠小肠上皮细胞的凋亡率，改善放射性肠损伤所致的小鼠体重下降、便潜血等项指标，同时提高小鼠受照射后的存活率。重组双歧杆菌灌胃，可以保护受照射小鼠肠道粘膜的完整性、保护肠道屏障作用，降低毒血症发生，降低血中炎性因子水平。 在本研究获得的重组双歧杆菌菌株基础上，开展深入研究，有可能研制出生产工艺简单，成本低廉，不需要提纯蛋白，无需多次注射，无需冷藏储存的新型抗放射损伤菌株口服制剂，具有潜在的应用开发前景。 北京大学基础医学院放射医学教研室 杨业鹏 供稿 2014.7.25