温度下酶解过滤除去菌丝片段.PPT

原生质体育种 Weibull等于1953年首次用溶菌酶处理巨大芽孢杆菌细胞获得原生质体，并首次提出原生质体的概念。 Mcquillen于1955年首次发现巨大芽孢杆菌原生质体再生方法。 1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出原生质体融合。 与正常细胞相比，原生质体具有一些新的独特的特性 1、由于去除了细胞壁，对外界环境影响更加敏感，对诱变剂的诱变效应也更为强烈。 2、破壁后细胞表面的受体和噬菌体的结合部位相应不存在，失去对噬菌体的敏感性。 3、由于解除了遗传物质的最大屏障—细胞壁，也不受感受态的影响，可进行原生质体转化和融合等基因重组。 以微生物原生质体育种的常见的育种方法有：一、原生质体再生育种二、原生质体诱变育种三、原生质体转化育种四、原生质体融合育种 一、原生质体再生育种 1、定义：制备原生质体—直接再生—筛选高产变异株 2、产生比常规诱变还高的正变率，其原因有以下方面： （1）原生质体比较敏感，制备和再生过程中的各种化合物及环境中的物理因子对染色体或质粒DNA都有一定诱变效应。 （2）原生质体再生本质上是细胞壁重建和分裂能力的恢复的过程，再生的细胞壁在组成和结构上发生变化，甚至于产生有利于细胞代谢产物分泌的变异。 （3） （4）原生质体再生材料无需经过遗传标记，减少了对菌株的损伤和优良性状的菌株。 3、实例： 弗氏链霉菌再生后，泰乐菌素产量提高3倍 产二素链霉菌再生后，螺旋霉素产量提高2倍 原因可能为13%-85%的质粒脱落， 解除抗生素 的调节机制。 4、原生质体再生育种一般程序 出发菌株的选择 二、原生质体诱变育种 1、定义： 以微生物原生质体为原料，物理化学诱变剂处理，再生培养基再生，从中筛选高产菌株。 2、原生质体作为诱变材料的优点 ①单孢子壁结构致密牢固，不利于诱变剂向核内渗透。 ②孢子代谢缓慢，造成基因突变频率较低或因表型延迟而漏筛。 10ml对数期微生物培养为离心收集菌体 出发菌株的培养和原生质体制备 三、原生质体转化育种 1、转化 染色体DNA或其他线状染色体转化原生质体效率低，质粒DNA具有高频转化率。 2、影响原生质体转化的因素 ①融合促进剂PEG来源、批号及聚合度。 ②制备原生质体的菌丝年龄、菌丝生长条件、原生质体再生条件。 ③转化时，质粒及原生质体的浓度。 ④再生培养基的组成。 对数期微生物培养为离心收集菌体 四、原生质体融合育种 原生质体融合（protoplast fusion）20世纪70年代发展起来的基因重组技术。 Fodorhe Schaeffer于1976年分别报道了巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌种内原生质体融合，微生物融合现象得到证实，并建立了相应的试验体系。 不足之处是原生质体融合后DNA交换和重组是随机的发生，增加重组体分离筛选的难度。 此外细胞对异体遗传物质的降解和排斥作用，以及遗传物质非同源性等因素也会影响原生质体融合的重组频率，使远缘融合存在较大困难。 二、原生质体融合育种程序 （一）直接亲本及遗传标记的选择 （二）原生质体的制备与再生 （三）原生质体融合 （四）融合体再生 （一）直接亲本及遗传标记的选择 一般把诱变谱系中筛选获得的不同正变株作为直接亲本进行融合。 现在认为融合亲本应采用较大差异的近亲菌株。 标记：营养缺陷型，抗性 热致死（灭活）孢子颜色菌落形态 遗传分析：采用营养缺陷型，抗性 提高产量：热灭活 荧光染色标记 （二）原生质体的制备与再生 1、制备: 原生质体分离：机械法、非酶法和酶法 （1）平板玻璃纸或摇瓶振荡培养 （2）取年轻菌体于高渗溶液中，加有关酶液，pH、温度下酶解 （3）过滤除去菌丝片段 （4）低速离心弃上清,高渗溶液重悬 （1）影响原生质体制备的因素 培养基组成 Musilkova等研究发现，黑曲霉在限制性培养基或合成培养基中分离原生质体的数量会显著增加。 放线菌只有在加入甘氨酸的培养基中培养后，才能使酶类易于渗入和瓦解细胞壁。 ②菌体的培养方式 丝状菌常用平板玻璃纸法 细菌和酵母多用振荡沉没培养法。 ③菌体菌龄 丝状真菌以年轻的菌丝来分离原生质体，尤其菌丝尖端细胞。酵母和细菌采用对数期。 大部分丝状菌采用菌丝作为分离原生质体的材料 ④稳定剂 原生质剥离细胞壁，对渗透压敏感，要在高渗溶液中酶解。 作为稳定剂的有： 无机盐：NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2 有机物：糖和糖醇，如蔗糖、甘露醇、山梨醇。 试验表明： 无机盐对丝状真菌效果好 糖和糖醇对酵