试验十五叶绿体的分离与荧光观察.PPT

实验十五 叶绿体的分离与荧光观察（选做，综合性实验，6学时） 实验目的 通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，熟悉荧光显微镜的使用方法。 实验原理 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L NaCl或0.4mol/L 蔗糖溶液)中进行,以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤.将匀浆液在1000r/min的条件下离心2 min,以除去其中的组织残渣和一些未被破碎的细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5 min,即可获得沉淀的叶绿体。 实验用品和材料 材料：新鲜菠菜 用品：离心机；捣碎机；荧光显微镜 试剂： 0.35mol/L NaCl 0.1%吖啶橙 实验方法 新鲜菠菜30g(加150ml NaCl) 捣碎(5000r/min的)匀浆3-5 min 6层纱布过滤 取滤液4ml 1000r/min离心2 min,弃沉淀 上清夜在3000r/min离心5 min,弃上清,沉淀即为叶绿体 将沉淀用0.35mol/L NaCl溶液悬浮 取悬液一滴于载玻片上,加盖片在普通显微镜下观察 取悬液一滴于载玻片上,再加一滴0.1%吖啶橙, 加无荧光盖片,在荧光显微镜下观察 实验结果 普通光镜下,可看到叶绿体为绿色橄榄形,在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒,即基粒。 以Olympus荧光显微镜为例，在选用B（blue）激发滤片，B双色镜和O530（orange）阻断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。 在加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出橘红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。 思考题 叶绿体分离的实验原理是什么？在分离叶绿体时应注意哪些问题？ 普通显微镜和荧光显微镜有何异同？ * * *