植物分子生物学实验指南 (美)P.马利加(PalMaliga)等著刘进元.pdf

第一章　　聚乙二醇介导的烟草叶肉原生质体 的转化 ： 一个研究 与 重组的实验 导 论 本 章介绍 了核酸 转化 植物 叶 肉原生质 体及分 析所 编码 蛋 白瞬 时表 达 的实验程 序 虽 然在 多数情 况 下应用 稳 定转 化材料 可 能更好 些 ，但 向植物 原生质 体 瞬时导入 外源 大分 子 ，可 以更快地对被导入材料 的生物学活性进行分析 。瞬时检测手段具有 易操作性 ，例 如可利于鉴定启动子 区的顺式作用调节序列 （参见 ， 比较 不 同启 动 子 间 的转 录 强 度 （见 ， 以及 研 究环 境 因子对 基 因表 达 的影 响 （见 。在 分子转化细胞 的实验 中，瞬时检测方法在确定信使 和 病毒 的有 效成熟 、稳定性和翻译 的顺式调控方面 已取得 了显著 的进展 （参见 。最近在进行转录 因子分析 的实验 中，蛋 白质 已被 瞬时导 入到植物细胞 中 （ 。本章将在对转基 因植物 中 分子 的生物学 活性的检测进行介绍的同时，为大家提供一个稳定转化和瞬时导入相结合 的应用范例 。 聚乙二醇介导的转化 将 转入植 物 细胞 有 很 多方 法 （参 见 的综述 ）。其 中的聚 乙二醇 介导的转化常用于建立稳定转化和基 因的瞬时表达研究 （ 介 导 的转 化具有一 些优 点 。首先 ，在 达 到 最大 的基 因瞬时表达条件 时 ，被转化细胞 的存活率和细胞分裂速率很 高 （ ；其次， 介导 的转化所用 的材料和仪器较 常规和便宜 ；最后 ，进一步 的研 究 证 明这种简单可靠 的方法广泛适用于各种可制备原生质体 的植物和组织 。这里，本操作 方法是为研 究烟草 （ ）叶 肉原生 质 体 基 因组 中 已转入 基 因结构 内的位 点特异重组而设计的。 实验设计 本实验 的 目的在于检 测转化 所 引起 的烟 草基 因组 的重组事 件 。作 用于特 异位 点的重组酶是一个分子量为 的噬菌 体 ， 由 “重 组 控 制 ”一词 的第一二个字母组成 译者注 ）基 因 的表达 产物 ，它催化 ）位点处 个碱基序列 间的重组 。正如早先指 出的那样 ，这种特异性位 点重组 系统能介导植物细胞 的切 除、倒位和共整合 （ 。本实验 中重组酶 的作用 目标是 由农杆菌 ）介导转化并稳定地整合 进烟草基 因组 的一段 。这一结构 由一个花椰菜花 叶病毒 启动 子 （ 和萤火虫荧光酶 的 ）和胭脂碱合酶 的多聚腺苷酸 区 ）的融合片段 （ ）组 成 。但 片段与 启 动 子 方 向相 反 （如 图 所示 ）。这一片段 的一侧与 位点在一端相接，但方 向是相反的。 的转 录 则需要通过在 序 列相 邻 片段 的重 组 即 倒 位 。而 倒 位 所 必 需 的重 组 酶 则 由 结构 中的 基 因的瞬 时表达来提供 。这 一个嵌合 基 因 除 了 其原核 的核糖体结合位 点被移去外 ，与早先 的 ）