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毛细管电泳培训教材 内容选择 一.概述 电泳是电解质中带电粒子在电场力作用下，以不同的速度向电荷相反方向迁移的现象.利用这种现象对化学和生物化学组分进行分离的技术称之为电泳技术。丛20世纪30~40年代起 ,相继发展了多种基于抗对流介质的电泳技术(如纸电泳，凝胶电泳等).传统的电泳技术由于受到焦耳热的限制，只能在低电场强度下进行电泳操作，分离时间长，效率低.80年代初,细径毛细管被用于电泳，由此产生了一种新型的分析技术——毛细管电泳。 毛细管电泳(CE)又称高效毛细管电泳(HPCE),是指离子或带电粒子以毛细管为分离室,以高压直流电场为驱动力,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的液相分离分析技术。由于毛细管内径小，表面积和体积的比值大,易于散热，因此毛细管电泳可以减少焦耳热的产生,这是CE和传统电泳技术的根本区别。 高效毛细管电泳分析 high performance capillary electrophoresis 高效毛细管电泳的特点 第二节 毛细管电泳基本原理 二、电渗现象与电渗流 electroosmosis and electroosmotic flow 2.HPCE中的电渗现象与电渗流 3. HPCE中电渗流的流形 4. HPCE中电渗流的作用 三、HPCE中影响电渗流的因素 factors influenced electroosmosis 3. 电解质溶液性质的影响 4. 温度的影响 5. 添加剂的影响 进样系统 静压力进样和电动进样 进样体积一般在纳升级 进样长度必须控制在毛细管总长度的1%~2%，否则将影响分离效率 毛细管电泳的进样方式 injection method of HPCE 2. 电动进样方式 分离系统 检测系统 常用的检测方式是紫外-可见光吸收.检测器位于距样品盘约毛细管总长的2/3~4/5处,对毛细管壁内部分进行光聚焦； 此外，荧光，激光诱导荧光，质谱等检测方法也被应用于毛细管电泳; 高效毛细管电泳仪实图 电泳仪工作示意图 第四节 毛细管电泳的分离模式 一、毛细管区带电泳capillary zone electrophoresis ，CZE 二、毛细管凝胶电泳 capillary gel electrophoresis ，CGE 三、 胶束电动毛细管色谱（MECC ，MEKC）micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC 四、毛细管等电聚焦 capillary isoelectric focusing，CIEF 实验条件选择 毛细管电泳的缓冲溶液 缓冲溶液的类型、离子强度、pH等影响EOF、溶质的迁移行为和分离效率，浓度和 pH相同不同的缓冲溶液分离效果截然不同，要求： 1、有一定的pH调节范围 2、尽可能选择浓度高而产生电流小的缓冲溶液，一般浓度增加，EOF速度降低 3、缓冲溶液的表观淌度要尽可能接近样品的淌度，否则区带会变宽 所以要尽量选择pKa=pHm±1、电泳淌度与样品接近、无紫外吸收的化合物做缓冲溶液，再通过实验选出最佳试剂。 工作电压的选择： 工作电压与缓冲溶液的浓度、毛细管内径与长度等因素有关，应尽量选择不产生太大焦耳热的最高电压。根据欧姆定律在电泳条件下，改变电压测定相应的电流，做电压~电流曲线，取线性关系中的最大电压做为分离电压。线性以上的电压，焦耳热效应过大。 选择毛细管： 一般在25 ~100μm之间，自由溶液电泳多选用的是50μm和75μm内径的毛细管 ，分离的有效长度在40~60cm之间。CGE和CEC的分离长度一般控制在20cm上下，洗涤时0.1~1mol/LNaOH、水和缓冲溶液顺序冲洗。 添加剂的选择：常用的有以下几种 1、表面活性剂控制EOF的大小与方向，提高分离选择性和分离度 2、有机溶剂，如甲醇等降低EOF速度，优化分离条件 3、两性离子和金属盐，降低管壁对蛋白质的吸附，改善分离度和重现性 4、手性试剂，基于与溶质形成的配合物的配位常数的不同而进行对映体的分离，同时也扩大分离对象 5、其他如尿素、线性聚丙烯酰胺等 毛细管电泳分离模式选择 在分离生物样品时,通常需要根据分离的目的来选择分离方式,若测定样品的尺寸,就须选NGCE或CGE,偶可选CZE或MEKC,要测定样品的等电点,则应选用CIEF,在做亲和作用研究时,应首选ACE. 根据简单通用性原则,还是以CZE、MEKC为优，分离中性离子时优先考虑MEKC 分离蛋白质和多肽等两性样品时优先考虑CIEF 分离水难溶组分时，优先考虑非水毛细管电泳形式 条件选择流程