试验十一血清ALT测定赖氏法.DOC

实验十五 血清ALT测定（赖氏法） 【目的】 1.了解血清ALT活性测定的原理及测定方法。 2. 掌握血清ALT 活性测定的临床意义。 【原理】 丙氨酸与α-酮戊二酸在丙氨酸氨基转移酶（ALT）的作用下生成丙酮酸和谷氨酸。在反应到达规定时间时，加入2，4-二硝基苯肼-盐酸溶液以终止反应。生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。后者在碱性条件下显棕红色。根据颜色的深浅，求得血清中丙氨酸氨基转移酶的活力。反应式如下： 【器材】 试管、刻度吸管、恒温水浴箱、分光光度计。 耗材：血清，座标纸等。 【试剂】 1. 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4） 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4，AR)11.928g，磷酸二氢钾(KH2PO4，AR)2.176g，加少量蒸馏水溶解并稀释至1 000ml。 2. ALT底物液 称取α-酮戊二酸29.2mg，DL丙氨酸1.79g于烧瓶中，加0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液80ml,煮沸溶解后冷却，用1mol/L NaOH调节pH至7.4（约加入0.5ml），再用0.1mol/L 磷酸盐缓冲液在容量瓶内加至100ml，混匀，加氯仿数滴，置冰箱可保存数周。 3. 丙酮酸标准液（2μmol/ml） 精确称取丙酮酸钠(AR)22.0mg于100ml容量瓶中，加0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液至刻度。 4. 2，4-二硝基苯肼溶液 称取2，4-二硝基苯肼19.8mg，用10mol/L盐酸10 ml溶解后，加蒸馏水至100ml，置棕色瓶内，冰箱保存。 5. 0.4mol/L NaOH溶液 称取16gNaOH溶于适量蒸馏水中，然后稀释至1 000ml。 【操作】 取2支试管按下表操作： 表3-16 血清ALT测定（赖氏法）操作步骤 加入物（ml） 测定管 对照管 血清 0.1 0.1 ALT底物液 0.5 － 混匀，置37 oC水浴，保温30分钟 2，4－二硝基苯肼 0.5 0.5 ALT底物液 － 0.5 混匀，置37 oC水浴，保温20分钟 0.4mol/L NaOH 5.0 5.0 混匀，静置10分钟，用505nm 波长比色，以蒸馏水调零，读取各管吸光度，用测定管吸光度值减去对照管吸光度值，查标准曲线得ALT活力单位。 【标准曲线绘制】 见下表： 表3-17 血清ALT测定（赖氏法）标准曲线绘制操作步骤 加入物（ml） 管 号 0 1 2 3 4 5 丙酮酸标准液（2μmol/ml） 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 ALT底物液 0.05 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 混匀，置37 oC水浴，保温30分钟 2，4－二硝基苯肼 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 混匀，置37 oC水浴，保温20分钟 0.4mol/L NaOH 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 相当于ALT单位 0 28 57 97 150 200 混匀，静置10分钟，用505nm 波长比色，以蒸馏水调零，读取各管吸光度，将各管吸光度值减去“0”号管吸光度值，以吸光度为纵坐标，各管相应的酶活性单位为横坐标，绘制成标准曲线。 【正常参考范围】 5～25卡门氏单位 赖氏法的酶活力单位是根据本法中丙酮酸量及其吸光度值与卡门氏单位的对等关系，套用卡门氏单位而来。 卡门氏单位的定义是：血清1ml，反应液总量3ml，反应温度25℃，波长340nm，比色杯光径1cm，每分钟吸光度减少0.001为一个卡门氏单位。 【临床意义】 ALT主要存在各组织细胞中，以肝细胞中含量最多，正常情况下只有极少量释放入血，血清中ALT活性很低。当肝细胞病变、坏死或肝细胞膜通透性增加时，ALT可大量释放入血，使血中该酶的活性显著升高，故此酶是判断肝细胞损伤的一个常用的指标。 急性肝炎、药物中毒性肝细胞坏死时，血清ALT 活性明显升高；肝癌、肝硬化、慢性肝炎、心肌梗死时，血清ALT活性中度升高；阻塞性黄疸、胆管炎时，血清ALT活性轻度升高。 【结果及分析】 【思考题】 1. 血清ALT活性升高有何临床意义？ 2. 简述ALT测定的实验原理。 3、ALT的正常值是多少7 4、对照管的意义是什么? 5、底物液为何要37℃预温5分钟