蝴蝶兰叶片铁氧还蛋白NADP氧化还原酶基因之选殖及表现分析.DOC

蝴蝶蘭葉片鐵氧還蛋白：NADP+氧化還原酶基因之選殖及表現分析 Cloning and expression analysis of ferredoxin-NADP+ oxidoreductase gene from the leaf of Phalaenopsis orchid 研究生：蔡宜容 Yi-Jung Tsai 指導教授：陳福旗博士Dr. Fure-Chyi Chen 【摘要】 在高等植物中鐵氧還蛋白：NADP+氧化還原酶 (FNR; EC 1.18.1.2) 是一種親水性的蛋白質，於光合作用電子傳遞的過程中催化NADP(H)和鐵氧還蛋白(ferredoxin; Fd)之間的電子傳遞。本研究目的是利用扣除雜交法由蝴蝶蘭葉片選殖出可能與葉片黃斑有關的基因-鐵氧還蛋白：NADP+氧化還原酶基因PLFNR的 cDNA，全長核苷酸序列為1308 bp，包含1095 bp的開放讀寫區(open reading frame, ORF)，可轉譯為364個胺基酸序列；上游未轉譯區(5’ UTR)長度為38 bp、下游未轉譯區(3’ UTR)長為175 bp。蝴蝶蘭基因組DNA以限制酶切割，經由南方雜合方式分析推測蝴蝶蘭基因組DNA中只有一個PLFNR基因拷貝數。利用相對定量PCR方式檢測PLFNR於蝴蝶蘭不同組織部位表現量，結果顯示PLFNR於蝴蝶蘭之葉片表現量較高，且在正常葉片較黃斑葉片表現量高；蝴蝶蘭PLFNR基因在葉片之表現量會隨著光照時間的增加而增加，而在黑暗下則會隨著時間的增加而減少；在根尖的表現則相反。此結果顯示蝴蝶蘭的葉片和根部PLFNR基因的表現可能和日韻律相關，而根部可能有另外型式的FNR，導致其表現情形與葉片有差異。分別選殖PLFNR基因之啟動子、構築PLFNR cDNA正向基因之載體、及選殖PLFNR基因之啟動子並構築PLFNRp::GUS載體。PLFNR啟動子可驅動GUS基因表達，並且表達在轉殖菸草幼苗的各組織中。菸草轉殖株 (PLFNRp::GUS) 之花朵經由GUS報導基因分析，結果顯示PLFNR啟動子所驅動的GUS報導基因在不同生長階段之花朵有不同的活性。菸草T1轉殖株 (PLFNRp::GUS)於自然光照下無論是葉片或根部組織GUS活性分析所呈現之藍色反應高於光照12h/黑暗12h和持續黑暗的環境條件。PLFNR基因過量表達時可增加轉殖植物對於光氧化和氧化還原循環-氧化劑 ( redox-cycling oxidants ) 的耐受性。本試驗的結果提供了蝴蝶蘭黃斑葉片植株與PLFNR基因表現之間的可能關聯性的證據。也初步瞭解PLFNR基因和啟動子對於光反應和PLFNR基因對於氧化逆境的影響。 關鍵字：蝴蝶蘭、鐵氧還蛋白：NADP+氧化還原酶(FNR)、黃斑葉片 【Abstract】 In higher plants, ferredoxin NADP+ oxidoreductase (FNR; EC 1.18.1.2) is a hydrophilic protein that catalyzes electron transfer between NADP(H) and ferredoxin in the final step of linear photosynthetic electron transport. The objective of this study was to clone the gene PLFNR, by cDNA suppression subtractive hybridization analysis, which might be related to chlorotic spots in leaves of Phalaenposis when down-regulated. The cloned Phalaenposis PLFNR cDNA sequence contains 1,095 bp open reading frame (ORF) encoding a protein of 364 amino acids, 38 bp 5’UTR and 175 bp 3’UTR. At least one copy of PLFNR gene is present in Phalaenposis genomic DNA by Southern blot analysis. Analysis of PLFNR expression by quantitative RT-PCR showed that the relative transcript level in leaves is higher than other tissues. Its expressio