基于功能化纳米颗粒和仿生材料的生化分析新方法-分析化学专业论文.docx

博士学位论文 博士学位论文 基于功能化纳米颗粒和仿生材料的生化分析新方法 基于功能化纳米颗粒和仿生材料的生化分析新方法 PAGE PAGE IV III III 摘 要 利用免疫分析技术对复杂基质中的目标 分析物进行高灵敏度和高选择性的 检测，是现代生物化学和生物医学研究领域中极具吸引力的热点课题之一。特别 是，在临床医学免疫诊断中，检测病人样品中的痕量疾病标志物对实现相关疾病 的早期诊断、早期治疗以及病因的探索具有极为重要的意义。目前免疫分析方法 已有许多报道，但这些方法大多存在操作复杂耗时、通量低、仪器昂贵、试剂和 样品耗费量大、对操作人员要求较高的专业技能等诸多问题。因此，开发一些快 速、高通量、低成本且易于临床推广和现场应用的免疫分析新方法是一件很有价 值的工作。此外，由于电化学酶生物传感器具有灵敏度高、制造简单、价格低廉 等诸多特点，它们在生化分析中的应用受到了人们越来越多的关注。但是，酶生 物分子固定化技术一直是制约这类微型分析装置快速发展与广泛应用的“瓶颈”。 针对当前免疫分析方法和酶生物分子固定化平台构建中存在的焦点和难点问题， 本论文创新性地应用荷叶和贻贝仿生膜，并结合使用功能化生物纳米颗粒，发展 了一系列单/多组分免疫检测新方法以及基于新型生物分子固定化平台设计 的电 化学酶生物传感器，实现了对目标物的高灵敏测定。主要内容如下： （1）探寻有效的途径用于降低昂贵的试剂和珍贵的生物样品的用量，将有 助于降低具有诸多优点的悬浮免疫分析的检测成本，使其更易于推广应用。在第 2 章中，首次将荷叶仿生超疏水表面引入悬浮免疫分析平台的设计。以聚碳酸酯 为模型聚合物，通过选择合适的溶剂和非溶剂，提出了一种基于非溶剂诱导相分 离的超疏水表面制备新方法。结果表明，新方法可于室温下在多种材料基底表面 上快速制备同时具有高的水的接触角（约为 160°）和低的水的滑动角（小于 5°） 的超疏水聚碳酸酯膜。该膜还具有良好的抗腐蚀性能和机械稳定性。随后，在普 通检测试管（即 10 mL 离心管）内壁表面上修饰聚碳酸酯膜，首次制备了一种基 于超疏水表面的悬浮免疫分析平台（ superhydrophobic surface-based suspension immunoassay platform, SSBSIP）。进而利用该新平台，以人免疫球蛋白 G（IgG） 为模型分析物，发展了一种基于金增强纳米金标记信号放大的磁悬浮比色免疫分 析新方法。研究结果表明，SSBSIP 在轻微机械振荡条件下即可实现悬浊反应溶 液（如免疫磁探针与样品）的最大限度的均匀混合，形成具有较高抗原-抗体结 合效率和较快免疫反应动力学的“循环流动反应体系”。基于 SSBSIP 的新方法仅 需较小的试剂和样品用量（如单步免疫反应中仅需 10 μL），可实现对人 IgG 的 快速（如单步免疫反应仅需 20 min）、高灵敏的比色检测，检测下限约为 25 ng/mL。 此外，SSBSIP 还具有自清洁能力，可反复使用。 （2） 日本血吸虫病是一种古老的地方性传染疾病，严重威胁着广大疫区人 民的身体健康，成为世界上亟待解决的一个严重公共卫生问题。在第 3 章中，应 用开发的 SSBSIP 新平台，结合铜增强纳米金标记信号放大策略，成功发展了一 种磁电化学金属免疫分析新方法，用于定量检 测感染兔血清中的日本血吸 虫抗 体。研究结果表明，通过协同使用牛血清白蛋白-正常兔血清双重封闭试剂和免 疫磁分离以将非特异性吸附影响降至最低，本方法可实现对浓度范围在 2 ng/mL ~ 15 μg/mL 的血吸虫抗体的特异检测，检测下限约为 1.3 ng/mL。与最近报道的 其他血吸虫抗体检测方法相比，新方法在试剂和样品用量、单步免疫反应时间、 检测下限等方面具有显著优势。用于实际样本分析时，该方法不仅能很好地鉴定 血吸虫感染血清的感染程度，而且可获得与经典的酶联免疫吸附法（ELISA）基 本一致的结果，表明其可望用于日本血吸虫病的临床生化诊断。 （3）多组分免疫分析法，由于具有分析通量高、试剂和样品消耗少、分析 成本低等突出优点，近年来成为免疫分析研究中的热点之一。在第 4 章中，采用 电化学沉积手段将廉价的铅笔石墨上的石墨颗粒修饰上具有微米结构的金层，制 备了由金修饰石墨颗粒构成的微电极阵列，进而将其应用于基于电化学阻抗图谱 的多组分免疫分析新方法研究。在单分析物实验中，通过结合基于纳米金的信号 放大策略，使用该微电极阵列的阻抗免疫传感器可实现对浓度范围在 0.05 ~ 100 ng/mL 的人 IgG 模型分析物的高灵敏检测，检测下限约为 36 pg/mL。与使用普通 金电极的情况相比，该传感器的检测灵敏度约高出三个数量级。此外，所引入的 电位控制单分子层功能膜组装（脱