间充质干细胞的扩增及其对造血干祖细胞和淋巴细胞增殖的影响-内科学(血液学)专业论文.docxVIP

中国协和医科大学中豳医学科学院博士论文阔充质干细胞的扩增及其对造血干／祖 中国协和医科大学中豳医学科学院博士论文 阔充质干细胞的扩增及其对造血干／祖 缨憝纛漭薹缨腿增殖静影昀 摘 要 研究目的： 1建立一种从成人骨髓中分离和扩增间充质干细胞(MSC)的方法，并从细胞 形态、抗原表达、超微结构、体外分化能力、增殖方式和细胞周期等方面研究其 生物学特性，并对其加以鉴定。 2探讨MSC在体外对脐I血CD34+细胞增殖的促进作用和黏附分子表达的影响。 3探讨MSC在体外对淋巴细胞增殖的抑制作用。 研究方法： 1采用密度梯度离心法和直接贴壁法从正常人骨髓、脐血(CB)和外周血中分 离扩增MSC，通过细胞形态、免疫表型、向成骨细胞及脂肪细胞分化能力、超 微结构和细胞周期等方面对其鉴定。 2将cB CD34+细胞接种于IMDM培养基，将融合达80％的MSC用137CsN射15Gy 后作为滋养层支持CD34+细胞扩增，加入SCF、FL、TPO、IL．3等细胞因子，比 较不同培养条件对造血细胞增殖能力、集落形成能力及黏附分子表达的影响。 3将不同数量的MSC加入异基因混合淋巴细胞反应体系中，用3 H标记的脱氧 胸腺嘧啶核苷酸检测MSC对加入异基因混合淋巴细胞反应的抑制作用。用PHA 刺激CD4+细胞增殖，同时加入MSC，用流式细胞仪检测分析CD4+CD25+比例 的变化。 研究结果： 1 从12份骨髓标本中均可分离获得MSC，而从3份外周血和5份CB脐血标本中未 能获得形态均一的MSC。处于对数生长期的MSC@，只有约10％细胞处于增殖期， 而绝大部分处ff：G0／G1期，未分化的MSC表达Thy．1、SH2、SH3、SBl0、CD44、 CDl3、CD49e年I]CD29，不表达CD34、CD45、HLA．DR、CDl4和CD31，经过诱 导可以向成骨细胞和脂肪细胞分化；MsC在体外培养中分为两群，成纤维样的 中国协承i医科大学 中国协承i医科大学 中黼医学科学院博士论文 褐对成熟MSC(mMSC)帮体积缀小懿溺澎RS(rapidly self-renewing cells)缨蕊， 两群细胞的CD34、CD45、CD3、CDl9、CD33、HLA—DR、CD38均为阴性，而 CD90、CDl05、C166、CD29、CD44、CD49e、CD54、CDl3呈阳往，憾RS镭惑 表面抗原表达的阳性率和平均荧光强度酃明显低于mMSC，而CDl 17的袭达高予 mMSC。 2在J311),．IL一3的培养体系中，在MSC矛11细胞因子作用下，CB CD34+细胞扩增7 天和14天后，有核细胞(Nc)、CD34+细胞年11CDl33+细胞数，实验组均显著多于 对照组，实验组扩增11天的CFU—GM集落数显著多于对照组，扩增7天后实验组 和对照组的CD34+和CDl33+细胞比例均较扩增前明显下降，但实验组CD34+ HLA—DR一细胞比例较扩增前无显著改变，而对照组比扩增前显著下降。在未加 入IL．3的培养体系中，CB CD34+细胞培养8d后，实验组有核细胞、CD34+细胞、 CD34+CD38一细胞和造血祖细胞集落扩增倍数均显著高于对照组。实验组和对照 组CD34+细胞比例较扩增前均显著下降，但实验组CD34+细胞群中CD38一细胞和 HLA．DR一细胞比例较扩增前显著增高。扩增后CD34+细胞的ALCAM、VLA—o【4、 VLA．ct5、VLA—pl、HCAM、PECAM和LFA一1表达较扩增前无显著变化，虽然 ICAM．1和L一选择素表达下降，但实验组CD34+CD62L+和cD34+CD54+细胞的绝 对数显著增加。 3在MSC存在的条件下，淋巴细胞的增殖明显受到抑制，随着MSC数量的增 加，其对淋巴细胞增殖的抑制作用也相应增强；加入MSC的实验组CD4+CD25 +细胞比例高于未加入MSC的对照组，阳性率分别为(83．15士12．69)％和 (54．82士24．86)％。 研究结论： 1 通过上述实验方法可以从成人骨髓分离扩增获得足量的Msc，其在体外具 有高度的增殖能力和分化能力，细胞周期研究和电镜观察显示所培养的细胞仍保 持干细胞特性，其形态学特征、生长方式、表面抗原和培养周期等与文献报道一 致，研究证实所培养细胞确)bMSC。MSC；邑--个异质性的细胞群体，表达多种 粘附分子，其中包含的Rs细胞可能是一种更原始的基质前体细胞。 2 MSC可为Hsc体外扩增提供适宜的微环境，不但可以促进HSC的快速增殖， 还有助于抑制HsC分化，维持HsC的自我更新和干细胞池的扩增，并有助于保持 中国协和医科大学中图医学科学院{毒士论文蕊造盘羹建潜畿鞘翅巢畿力。 中国协和医科大学中图医学科学院{毒士论文 蕊造盘羹建潜畿鞘翅巢畿力。 3 M