建立几种赤潮藻的PCR-膜反向斑点杂交检测技术-遗传学专业论文.docxVIP

Classified Index： Q781 U.D.C：577 Dissertation for the Master Degree in Science DEVELOPMENT OF A PCR-BASED REVERSE DOT HYBRIDIZATION ASSAY FOR PARALLELDETECTION OF SEVERAL HARMFUL ALGAL SPECIES Candidate： Yang Liu Supervisor： Guofu Chen Associate Professor Academic Degree Applied for： Master of Science Speciality： Genetics Affiliation： School of the Marine Science and Technology Date of Defence： June, 2013 Degree-Conferring-Institution： Harbin Institute of Technology 哈 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文 哈 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文 I I PAGE PAGE VI 摘 要 赤潮藻的鉴定和检测是进行赤潮研究和预警的前提和基础，因此其方法学成为 当前国内外研究的热点。然而，基于形态学特征的传统赤潮藻的鉴定方法 (光镜法) 效率低、准确度不高，特别是不能对自然水样中的多赤潮藻进行并行检测。因此， 本文拟建立一种可同时检测多种赤潮藻的分子技术—PCR–膜反向斑点杂交。 研究选取了 6 中常见的赤潮藻，包括东海原甲藻 (Prorocentrum donghaiense)、 共 生 甲藻 (Symbiodinium sp.)、 赤潮 异湾 藻 (Heterosigma akashiwo) 、 热带 条藻 (Skeletonema tropicum)、柔弱角毛藻 (Chaetoceros debilis) 和新月菱形藻 (Nitzschia closterium) 为研究对象，首先通过提取基因组 DNA，对其核糖体大亚基 rDNA 序 列的 D1–D2 区 (LSU D1–D2) 进行 PCR 扩增；然后将 PCR 产物纯化回收，再将纯 化后的 PCR 产物与载体连接，将连接产物转入到大肠杆菌中进行克隆，通过蓝白斑 筛选，获得阳性克隆菌株并进行商业测序。 根据测序结果，采用 Array Designer 4.20 设计获得了各自的特异性分类探针， 并通过 Oligo 软件对探针进行评价，初步筛选出针对各种赤潮藻的备选探针 3 条； 采用 Primer Premier 5.0 设计出通用扩增引物；用反向斑点杂交对探针进行初筛，得 到各赤潮藻的探针 1 条；将探针进行地高辛 (Digoxigenin, DIG) 标记，选用 6 种常 见赤潮藻及其它常见微藻，通过正向斑点杂交对探针的特异性进行验证。 对探针进行加尾，并用其制备低密度膜芯片，采用 DIG 标记法对 PCR 产物进 行标记，初步建立了基于 LSU rDNA 的 PCR–膜反向斑点杂交体系，并进一步对膜 制备和杂交体系，包括探针用量、DIG 标记 PCR 产物的用量、紫外交联时间、杂 交温度、杂交时间和洗涤时间等进行优化。结果表明：设计的探针具有特异性；最 终的优化条件为：探针上样量 5 pmol，DIG 标记 PCR 产物 25 ng，紫外交联 30 s，42 oC 杂交 2 h，47 oC 洗膜 2 × 5 min。 为了验证 PCR–膜反向斑点杂交检测法的实用性，分别用不同浓度及不同固定 时间的模拟自然水样及自然水样作为样品，分别进行 PCR–膜反向斑点杂交测试。 结果表明：PCR–膜反向斑点杂交的检测极限为 0.1 cell/ml；含有 6 种目标藻混合藻 液用鲁哥氏液固定 1、3、5、10、15 和 30 d 后均能检测到 6 种微藻；该方法能成功 检测到自然样品的目标藻种，其结果与光镜镜检结果一致。 最后，本研究还对 10 种赤潮藻的 ITS 序列进行了克隆，并根据获得的序列设 计了种特异性探针，并通过正向斑点杂交验证了其特异性，并设计了基于 ITS 序列 并行检测多种有毒赤潮藻的低密度膜芯片，为进一步建立赤潮的基于 ITS 序列的 PCR–膜反向斑点杂交检测技术打下了基础。 关键词：赤潮藻；PCR；反向斑点杂交；探针；膜芯片；检测 Abstract The identification and detection of harmful algae is the premise and foundation for red tide research and warning, so its m