间歇低氧损伤后海马神经细胞自噬的表达及其作用研究-临床医学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。 本论文属于 保密 ，在 年解密后适用本授权书。 不保密 。 （请在相对应的方框内打“√” ） 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 导 师 签 名 ： 日期： 年 月 日 天津医 天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 目的：阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（OSAHS），是一种发病率较高的 睡眠呼吸障碍性疾病，同时也是神经系统认知功能障碍发生发展的重要危险因 素。间歇低氧（IH）作为 OSAHS 主要的病理生理学特征，其反复发生的低氧/ 复氧过程可以诱导海马神经细胞损伤。认知功能障碍作为老年 OSAHS 患者常见 并发症，其发生机制可能与间歇低氧所致海马神经细胞损伤有关。自噬是维持 细胞稳态的重要生理机制，近年来有研究发现自噬在缺血/缺氧所致系统性损伤 中发挥重要作用。然而在间歇低氧条件下，自噬激活的具体机制以及自噬对神 经系统损伤的影响目前尚未清楚阐明。因此，本研究通过模拟人 OSAHS 建立间 歇低氧模型，从体外实验角度观察间歇低氧损伤后海马神经细胞自噬的表达， 并进一步通过药物干预检测间歇低氧所致海马神经细胞自噬流量的变化，拟探 讨自噬的激活在间歇低氧所致海马神经细胞损伤中的作用。 方法：取新生 SD 乳鼠（24 小时内）海马组织进行原代神经细胞培养，至 第 7 天，采用免疫荧光对海马神经元进行鉴定。①建立不同时间段的间歇低氧 细胞模型，设正常对照组（NC）、间歇低氧组（IH）4h、间歇低氧组 8h 和间歇 低氧组 12h。间歇低氧组分别循环给予氧浓度为 1.5%的低氧 5min 和 21%的常氧 10min 处理 4h、8h 和 12h，正常对照组持续给予氧浓度为 21%的常氧。采用免 疫荧光和免疫印迹检测间歇低氧不同时间段内自噬特异性微管相关蛋白轻链 3 （LC3）、Beclin1 和活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved caspase-3）蛋白 的表达，TUNEL 法检测不同时间段内海马神经细胞凋亡的变化。②给予自噬激 活剂雷帕霉素和抑制剂氯喹预处理后再建立间歇低氧细胞模型，设正常对照组、 间歇低氧组（12h）、药物预处理组、单独给药组和饥饿组。间歇低氧组于间歇 低氧舱内处理 12h；药物预处理组分别给予雷帕霉素和氯喹稀释液预处理 12h 后， 再置于间歇低氧舱内暴露 12h；单独给药组分别给予雷帕霉素和氯喹处理 12h； 饥饿组即间歇低氧阳性对照组给予 EBSS 无糖培养液培养 12h。采用免疫印迹检 测各实验组自噬相关蛋白 LC3-I 向 LC3-II 的转化，即 LC3-II/LC3-I 和 P62 蛋白 的表达。③实验模型的建立及实验分组同步骤②。采用免疫印迹检测各实验组 自噬相关蛋白 LC3-II 和 cleaved caspase-3 的表达，免疫荧光检测各实验组 LC3 蛋白表达，TUNEL 检测各实验组海马神经细胞凋亡的变化。 结果：①间歇低氧对新生鼠原代海马神经细胞自噬相关蛋白表达的影响： I 间歇低氧组自噬相关蛋白 LC3 和 Beclin1 表达明显增多，且随着间歇低氧时间的 延长 LC3 和 Beclin1 表达也逐渐增多。间歇低氧 12h 表达最多，与正常对照组相 比，差异具有统计学意义（**P0.05）。②间歇低氧对新生鼠原代海马神经细胞 自噬流量的影响：与正常对照组相比，间歇低氧组 LC3-II/LC3-I 表达显著增多， 而 P62 蛋白表达则明显降低，差异均具有统计学意义（**P0.05）；与雷帕霉素 单独给药组相比，雷帕霉素+间歇低氧组 LC3-II/LC3-I 表达显著增高，而 P62 蛋 白表达则明显降低，差异均具有统计学意义（**P0.05）；与氯喹单独给药组相 比，氯喹+间歇低氧组 LC3-II/LC3-I 表达显著增高，P62 蛋白表达则明显降低， 差异均具有统计学意义（***P0.05）；与正常对照组和 DMSO 组相比，雷帕霉 素单独给药组 LC3-II/LC3-I 表达显著增高，差异具有统计学意义（*P0.05， **P0.05），而 D