胶体金速测卡研制及柑橘溃疡病菌快速诊断-生物学专业论文.docxVIP

重庆大学硕士学位论文中文摘要 重庆大学硕士学位论文 中文摘要 I I 摘 要 柑橘溃疡病(Citrus bacterial canker disease，CBCD)是一种由柑橘黄单胞菌 (Xanthomonas citri pv.citri,Xcc)所引起的，危害全世界柑橘种植业最严重的检疫性细 菌病害。该病能侵染绝大多数多种芸香科植物，包括柑橘属的绝大多数商品化栽 培品种。该病主要随带病种苗等繁殖材料远距离传播，发病严重时往往导致树势 衰退，枯枝落叶、布满病斑、果实品质恶劣甚至未熟先落，严重影响柑橘的产量 和质量。由于抗病品种和特效药剂的匮乏，针对发病植株仍采用挖除病树集中烧 毁的铲除方式。目前对该病的防控措施主要依靠加强植物检疫检测，早期诊断病 害，切断传播源头。随着我国经济快速发展，柑橘产品的调运和交易更加频繁， 人为传播的危险性急剧加大，在这样的形势下迫切需要更多更好的检测技术手段， 特别是快速简便、可用于现场诊断的方法。 胶体金溶液分散相中的金原子直径在 l~150nm 之间，随着颗粒大小的不同溶 胶颜色呈现由红到紫的变化。胶体金免疫技术(ICG)是以胶体金颗粒作为显色物质 或示踪标记物，标记于抗原或抗体上，直观反映抗原抗体之间相互作用的新型免 疫标记技术。胶体金颗粒本身无毒，能够迅速而稳定地吸附于所有生物大分子上， 但不改变大分子的生物活性，因此作为一种安全的探针它可以进行切片定位及日 常诊断技术。其优点是快速、灵敏、特异性强、稳定性好，且操作简便、无需任 何仪器设备，结果判断直观可靠、易被基层人员掌握。因而在电镜、免疫印迹、 体外诊断试剂盒的制造、药物残留测试、临床疾病诊断等等领域都得到了广泛的 应用。 本研究针对柑橘溃疡病菌现有检测技术在基层田间难于进行现场快速诊断的 缺陷，利用重庆大学基因工程研究中心前期筛选的重组抗体，制备并比较单克隆 抗体、多克隆抗体与重组抗体的实际应用性能，研发柑橘溃疡病菌快速诊断胶体 金速测卡，可望为柑橘溃疡病菌的诊断提供一种简便、快速、便于基层使用的检 测手段。主要研究结果如下： ① 将制备并提纯的抗 Xcc 单克隆抗体、多克隆抗体及重组抗体，采用间接 ELISA 方法对比，筛选出两株特异性强、稳定性好的抗体(Xcc-2D8 和 Xcc-2D6 效 价均为 1:128,000 以上)，应用于胶体金速测卡的研发。 ② 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，所制金溶胶状态为鲜红透亮，离 心无挂壁无黑色颗粒沉淀。通过紫外 400~600nm 扫描，吸收峰宽小，粒子分布均 匀，最大吸收峰波长在 520nm 左右，为标记所需颗粒大小。 ③ 通过 pH 梯度测定金标抗体最适 pH 标记范围在 9.0~9.5 左右。通过抗体浓 II II 度梯度测定金颗粒最适添加抗体量在 20mg/mL 以上。 ④ 确定各类层析材料以及各层析材料的预处理方式。金标抗体固定于金标垫 上；利用双抗夹心原理，将检测抗体(Xcc-2D6)和二抗抗体(山羊抗小鼠 IgG)分别固 定于硝酸纤维素膜上，作为检测线(T 线)和质控线(C 线)，经实验条件优化，组装 胶体金速测卡密封干燥保存。 ⑤ 用 Xcc 菌悬液及柑橘样本浸后液对所制胶体金速测卡进行检测评价。速测 卡对 Xcc 菌悬液的检测下限为 1×103~4cfu/mL，对多个地区的 206 份柑橘样本进行 实际检测所得结果与 qPCR 方法所得结果具有较高一致性(kappa 值=95.15%)，检测 时间控制在 10 分钟以内，对其他植物致病菌、柑橘伴生菌及常见细菌无交叉反应， 说明胶体金速测卡特异性良好，各批次间速测卡无差异，保存稳定。 关键词：柑橘溃疡病菌，胶体金，单克隆抗体，免疫层析 重庆大学硕士学位论文英文摘要 重庆大学硕士学位论文 英文摘要 PAGE PAGE IV ABSTRACT Xanthomonas axonopodis pv. Citri (Xcc) is one of the invasive pests, a bacterial HYPERLINK dict://key.0895DFE8DB67F9409DB285590D870EDD/citrous citrous plant pathogen that causes citrus canker(Citrus bacterial canker disease, CBCD), which is the most serious citrus bacterial diseases of quarantine. The disease could infect a variety of rutaceae plants, including all the commercial citrus