拮抗香蕉枯萎病菌的LX1菌株的分离鉴定及共抑菌蛋白的分离纯化与该基因的克隆-农业生物技术专业论文.docxVIP

海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明原创性声明 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明： 所早交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写 过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名： 矗随 日期：≥t∥年∥月歹日 1 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南人学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留-Ji-晦1 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电予版，允许论文被夯阅和借阅。本人授权海南人 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采川影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。本人在导师指导一I-完成的论文成果，知识产权归属海 南火学。 保密论文在解密后遵守此规定。 论文作者躲芋桶 导师妣询炒 日期：z口『f年6月；日 日期：M 1年易月)日 本人已经认真阅读“CALLS高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论 文提交“CALLS高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关 权益。回盛途塞毽銮丘澄丘；旦坐生；旦：：生i旦三生蕴盔。 论文作者舭产填 日期：≥9“年历月多日 葡年游／日期。Ⅵ1年b月日 摘 摘 要 香蕉枯萎病的发生和流行，严重地威胁着香蕉产业的发展。鉴于长期使用化 学药剂会造成环境污染及病虫害抗药性的产生等一系列问题的出现，而选育抗病 品种也有着技术等种种困难，因此，生物防治成为环保、安全有效的防治香蕉枯 萎病的途径。本研究目的从海南盐碱地土壤样品中筛选出对香蕉枯萎病有强烈抑 制效果的菌种并探究其抗香蕉枯萎病菌的作用机制。主要研究结果如下： 1．从海南不同的盐碱地中分离得到的153个菌种中，对它们进行拮抗香蕉枯 萎病的活性检测，筛选出四个对香蕉枯萎病菌有较好的拮抗作用的菌株，其中有 LXl菌株对香蕉枯萎病菌的抑制作用最佳。 2．对LXl菌株进行常规生理生化鉴定、16S rRNA序列同源比较以及与枯草芽 孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌部分特异性基因序列分析。最终将LXI菌株鉴定为解淀 粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens。 3．对LXl菌株的最佳生长条件确定，LXI菌株的最适生长温度为37℃、最 适盐浓度为1％、最适PH为6．5。对LXl菌株的发酵上清液进行不同培养时间、 温度和不同PH值处理，测定处理后的发酵上清液的抑菌活性，结果发现：在100 ℃时抑菌活性大大减少，这表明LXl菌株发酵上清液的活性物质可能为抑菌蛋 白；PI{为7时抑菌活性最大：培养时间为24h时的发酵上清液的抑菌效果最佳。 4．蛋白粗提物对香蕉枯萎病菌有较强的抑制作用，而且与未经蛋白酶K处理 的蛋白粗提物的抑菌效果相比，其抑菌圈明显的变小，由此说明，LXl菌株的蛋 白粗提物中的抑菌物质对蛋白酶K敏感，进一步证明了LXl菌株的发酵上清液中 的主要抑菌物质含有抑菌蛋白。 5．用Sephacryl S-200HR柱层析、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析 分离纯化LXl菌株的抑菌最佳的蛋白，用SDS—PAGE凝胶电泳检测到该蛋白基本得 到纯化。把纯化的蛋白送至UProtTech公司测序。结果表明，该抑菌蛋白与Bacillus amyloliquefaciens FZB42内切葡聚糖酶同源性最高。 6．对该抑菌蛋白的基因进行克隆及序列测定，发现该蛋白基因的编码区有 1041bp，编码346个氨基酸。将测序结果于NCBI中BLAST比对分析，结果表明抗 菌蛋白核苷酸序列与Bacillus amylo脚uefaciens FZB42的内切葡聚糖酶的核苷酸 序列同源性达99％(有七个碱基差异)。抗菌蛋白氨基酸序列与Bacillus amyloliqruefaciens FZB42的内切葡聚糖酶氨基酸序列同源性达100％。 关键词：香蕉枯萎病解淀粉芽孢杆菌抑菌蛋白分离纯化基因克隆 AbstractBecause Abstract Because banana Fusmium wilt was bringing out and prevalent，commercial banana production faced、vim a serious threat．Nowadays，there iS no effective means of chemical control to the disease．Furthermore，chemical control has a series of problems like environme