核酸提取及常见问题分析.pdf

核酸提酸提取及常见问常见问题分分析 主讲人：刘召华 北京天为时代科技有限公司 内容内容 第一部分：DNA提取方法简介 第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策原因分析及其对策 第三部分第三部分：RNARNA提取方法简介提取方法简介 第四部分第四部分：RNA提取提取及其其RT-PCR常见常见 问题问题、、原因分析及其对策原因分析及其对策 前言前言前言前言 核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因 此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、 最基本的操作最基本的操作 。。 第一部分：第一部分：DNADNA提取方法简介提取方法简介 第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策原因分析及其对策 第三部分第三部分：RNARNA提取方法简介提取方法简介 第四部分第四部分：RNA提取提取及其其RT-PCR常见常见 问题问题、、原因分析及其对策原因分析及其对策 DNADNADNADNA提取的几种方法提取的几种方法提取的几种方法提取的几种方法  染色体染色体DNA的提取的提取  CTAB法  SDS法  其它 DNADNADNADNA提取的几种方法提取的几种方法提取的几种方法提取的几种方法  非染色体非染色体DNADNA的提取的提取  质粒质粒DNADNA的提取的提取 • 碱裂解法 • 煮沸法  线粒体、叶绿体DNA的提取 • 差速离心结合SDS裂解法 基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA－－ CTABCTABCTABCTAB法法法法  CTABCTAB法原理法原理 （（植物植物DNADNA提取经典方法提取经典方法））  CTAB （hexadecyyltrimethyylammonium bromide，十六烷基三甲基 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。  该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂 抽提抽提，去除蛋白去除蛋白、多糖多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。 注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。 基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA－－ CTABCTABCTABCTAB法法法法  CTABCTAB提取缓冲液的经典配方提取缓冲液的经典配方 TrisTris--HClHCl EDTAEDTA 组份 NaCl CTAB β-巯基乙醇 （pH8.0） （pH8.0） 0.1% （V/V ） 终浓度终浓度 100 mM 20 mM 1.4M 2%((W/V)) 使用前加入使用前加入  TrisTris-HClHCl （（pH8pH8.00））提供一个缓冲环境提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏防止核酸被破坏；  EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；  NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；  CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；  β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA－－－－ CTABCTABCTABCTAB法法法法  CTABCTAB提取缓冲液的