亲合组织化学技术.ppt

第五章 亲合组织化学技术 * ppt课件 发展历史 60年代：发现生物素和卵白素 70年代：植物凝集素、生物素、葡萄球菌A蛋白------BRAB、LAB、SPA-HRP、ABC… 亲和组织化学：1976年Bayer首次提出 包括植物凝集素和糖类、生物素和抗生物素、葡萄球菌A蛋白与IgG、阳离子与阴离子、激素、维生素、糖及类脂质作用部位和受体等 * ppt课件 植物凝集素(Lectin) 生物素(Biotin) 葡萄球菌A蛋白(SPA) SPA—HRP法、ABC法和LAB法等。 亲合组织化学技术 定义：是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础，建立的组织细胞基础化学技术。 本质：区别于一般的组织化学，非抗原抗体反应。 优点：敏感性高，有利于微量抗原（或抗体）在细胞或亚细胞水平的定位。 * ppt课件 一 抗生物素—生物素免疫细胞化学技术 二 葡萄球菌蛋白A技术 三 凝集素组织化学技术 四 其它亲和细胞化学 * ppt课件 一、抗生物素—生物素免疫细胞化学技术 (一) 基本原理 亲合素（抗生物素/卵白素） 是鸡蛋白中含有的一种碱性蛋白，属于糖蛋白;具有4个同维生素H (生物素)亲合力极高的结合点。 链酶亲合素 是一种从链酶菌培养物中提取的蛋白质，和亲合素一样，也有四个生物素结合位点，是一种亲和力更高的生物素结合蛋白。 生物素（维生素H） 是一种小分子的水溶性维生素，它与亲合素／链酶亲合素之间有很强的亲合 力，较之抗体对抗原的亲合力要高出100万倍，能够彼此牢固结合而不影响 彼此的生物学活性。 ★ 生物素、亲合素、链酶亲合素：能与荧光素、铁蛋白和过氧化酶等相结合。 ★ 亲合素、链酶亲合素：同一定浓度的生物素化酶混合后，形成亲合素一生物素一酶复合物。这种复合物可以和各种生物素标记抗体结合。 * ppt课件 （二）几种亲合素—生物素染色技术 1 亲合素一生物素—过氧化物酶复合物技术(ABC) 2．链酶亲合素-生物素-过氧化物酶复合物技术(SABC法) 3．标记生物素—抗生物素技术(LAB) 4.SP/SAP法 5.Envision法 6.CSA法 * ppt课件 ABC复合物： 亲和素－生物素－过氧化物酶复合物 1 亲合素一生物素—过氧化物酶复合物技术(ABC) * ppt课件 ⑴ 基本原理 是将亲合素作为“桥”与生物素化的抗体与生物素结合的酶（HRP)连接起来。 第一抗体：为未标记特异性抗体，能结合组织中待测抗原； 第二抗体：为生物素化的桥抗体，能与第一抗体结合； 第三抗体：是结合了过氧化物酶的亲合素复合物(即ABC) 。 优点： 敏感性强（比PAP高20-40倍）； 特异性强，背景染色淡； 方法简便，节约时间（比PAP缩短2h） ； 由于生物素与抗生物素具有和多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重免疫染色。 * ppt课件 ⑵ 操作步骤 ① 冰冻切片或石蜡切片均可。 ② 冰冻切片：丙酮固定，PBS 洗5min，更换3次。 石蜡切片：脱蜡，系列酒精至水。 ③ 第一抗体孵育，过夜。 ④ PBS洗5min，更换3次。 ⑤ 加生物素标记的第二抗体，孵育15min。 ⑥ PBS洗5min，更换3次。 ⑦ 加ABC复合物室温作用15min。 ⑧ PBS洗5min，更换3次。 ⑨ 用DAB显色。 ⑩ 复染、封片、观察。 ⑶ 结果 呈棕黄色为阳性表达，核被苏木精染成浅蓝色。 * ppt课件 (4) 注意事项 ①消除内源性生物素：染色前以0.01％的亲合素和0.01％生物素溶液分别作用20min以消除内源性生物素活性，每次作用后用PBS漂洗3次，5min。 ②消除内源性过氧化物酶：可用3％ H2O2孵育5-10分钟以灭活内源性过氧化物酶活性。蒸馏水洗3次。 ③试剂的保存：温度以4℃为佳，可达2年之久，在－20℃时其生物活性反而在短期内被破坏。 此外，生物素制剂之间相互亲和性差异大，注意厂家和批号。 * ppt课件 SABC法 原理： 一抗＋生物素化二抗＋SABC复合物 SABC复合物 链霉卵白素－生物素－过氧化物酶 生物素标记的二抗 链霉卵白素连接 生物素标记的酶。 优点：敏感性略高于SP法，低背景和操作简便 缺点：因体内含有内源性生物素，易产生非特异性染色。 一抗+生物素标记二抗+滴加试剂SABC（链霉卵白素+辣根酶标记生物素)+辣根酶底物显色 2 链酶亲合素-生物素-过氧化物酶复合物技术(SABC法) * ppt课件 SABC试剂盒(含正常血清，生物素化二抗，SABC等)