结核分枝杆菌ESAT6和CFP10蛋白的表达、纯化及初步应用-药理学专业论文.docxVIP

学位论文独创性声明本人呈交的学位论文系在导师指导下所取得的研究成果。除了文 学位论文独创性声明 本人呈交的学位论文系在导师指导下所取得的研究成果。除了文 中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他入已经发表或撰 写的研究成果，也不包含为获得广东医学院或其他教育机构的学位或 证书所使用过的材料。 ．作者签名： 趁 日期：丝么趁 学位论文知识产权声明 本人在就读研究生期间所完成的学位论文及其相关成果，知识产 权归属学校。本人在毕业离校前会将有关的研究资料和结果全部上交 导师，离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或 成果时，署名单位仍然为广东医学院。学校可以将学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文，‘可以公布(包括刊登)论文的全部或部 分内容。导师享有发表学位论文、申请成果和专利的权利。 注i保密的学位论文在解密后适用本声明。 作者签名： 日期： o参。台．7,o 导师签名： 日期： 中文摘要目的 中文摘要 目的 本实验利用基因工程技术，寻找制备结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis，MTB)6 kDa早期分泌性抗原靶(Early secreted antigenic target·6 kDa， ESAT6)、培养滤液蛋白10(Culture flit rate protein 10，CFPIO)、CFPl0-ESAT6重 组蛋白的方法和条件，并研究其免疫活性，为研究此三种蛋白作为临床诊断试剂 或预防治疗药物打下基础。 方法 1原核表达载体载体的构建： 设计pET32a(+)·ESAT6、pET32a(+)·CFPl0、pET32a(+)-CFPl0·ESAT6载体构 建策略，并运用DNAStar生物软件预测分析载体基因及重组蛋白的抗原位点。 分别设计ESAT6、a叩10引物，从MTB标准株H37Rv基因组中扩增ESAT6、 CFPl0片段，在ESAT6、CFPl0片段间加入linke洽成CFPl0．ESAT6融合基因；分 别定向克隆)＼pET32a(+)原核表达载体多克隆位点中，再经PCR、酶切等方法鉴 定并测序，筛选阳性重组子。 2 重组ESAT6、CFPl0、CFPIO．ESAT6蛋白(rEsAT6、rCFPl0、rCFPl0．ESAT6) 的表达与纯化 分别在不同浓度IPTG、不同时间、不同温度条件下对重组菌进行诱导，并 进行SDS．PAGE电泳分析，优化诱导条件，Westem—blotting检测、镍柱纯化目的 蛋白。 3表达蛋白的免疫活性与初步应用 ①将上述3个重组蛋白分别加弗氏佐剂每隔14d免疫小鼠三次。 ②将rESAT6蛋白和PPD分别体外刺激rESAT6蛋白免疫小鼠的脾淋巴细胞， M兀i去检测淋巴细胞增殖水平。 ③ 以rESAT6蛋白作为包被抗原与单抗HYB076．08作方阵滴定，rCFPIO、 rCFPIO．ESAT6两蛋白的包被量参考rESAT6浓度，三种蛋白都与阴性血清做方阵 滴定，确定抗原抗体的最佳工作浓度，间接ELISA法检测免疫小鼠血清抗体，评 估表达蛋白的免疫活性。 ④在检测免疫小鼠血清的ELISA法基础上，用rESAT6蛋白作为包被抗原与单抗 ④在检测免疫小鼠血清的ELISA法基础上，用rESAT6蛋白作为包被抗原与单抗 HYB076．08作方阵滴定，PPD组与阳性结核猴血清作方阵滴定，确定抗原抗体的 最佳工作浓度，以PPD为平行参照组，以rESAT6蛋白对结核病猴(PPD皮试阳性、 X光透视阳性)、健康猴(PPD皮试阴性、X光透视阴性)分别进行检测，以确定 rESAT6蛋白EL|SA法检测猴结核的有效性。 ⑤用上述rESAT6蛋白为抗原ELISA检测猴血清抗体的方法，以PPD ELISA方法 检测方法为对照，检Nlo只待检猴血清(同时设立阴性、阳性、空白对照)，检 测结果与PPDELISA、PPD皮试对比分析，初步应用于猴结核的检测。 娃田 二日7K 1 DNAstar预测分析结果表明外源基因大小正确，读码框无移位，重组蛋白的 抗原位点未被掩蔽。经酶切、PCR、测序鉴定，表明pET32a(+)．ESAT6、 pET32a(+)-CFPl0、pET32a(+)一CFPl0一ESAT6三个原核表达载体构建成功。 2重组目的蛋白的最佳诱导条件为IPTG浓度为lmM，25℃诱导6h，成功获得 rESAT6、rCFPl0及rCFPl0．ESAT6融合蛋白，可溶性目的蛋白表达量分别占全菌 可溶性总蛋白的35．5％、38．1％、18．7％，分离纯化后每gI程菌可获得的可溶性 目的蛋白量达2．247mg-6．536mg。 3 Western．blotting结果显示rESAT6蛋白与ESAT6单抗H