结核分枝杆菌H37Rv分泌滤液中糖蛋白的筛选-病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：当、＼寸＆孟玛 签字日期： 俎年』月旦目 学位论文版权使用授权书本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、 使用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机 构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权大连医科大学可以将本学位沦文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。 论文作者签名：圭!l丝堑l 指导教师签名：!塑垒态 签字日期： 俎年』月卫日 结核分枝杆菌H37Rv分泌滤液中糖蛋白的筛选博士生姓名：刘振桐 结核分枝杆菌H37Rv分泌滤液中糖蛋白的筛选 博士生姓名：刘振桐 指导教师：贾玉杰 教授 专业名称：病理学与病理生理学 摘 要 目前，结核病仍然是威胁人类健康的主要传染病，据世界卫生组织 统计，全球每年约有800万人感染结核分枝杆菌，300万人死于结核病。 如何有效的预防和控制结核病是人类面临的一个重要课题。通过对一些 细菌的研究表明，细菌糖蛋白与细菌致病性密切相关。其作用包括：保 持细胞结构稳定性：细胞表面及胞内识别；细胞粘附，调节及维持许多 生化特征：如蛋白可溶性，粘度，表面电荷等。由于目前发现的结核分 枝杆菌数量有限，所以寻找和发现新的结核分枝杆菌糖蛋白，研究它们 的功能和合成途径，对于全面了解结核病的发病机制以及研制新的抗结 核药物或疫苗具有重要意义。 通过对天然结核分枝杆菌不同组份(包括细胞壁，细胞膜，细胞质，细 菌分泌液等1分别进行研究检测，发现只有在胞外分泌液(culture filtrate protein，CFP)中有糖蛋白的存在。此外，通过研究结核分枝杆菌糖蛋白 的合成机制发现，只有底物是经过分泌途径到达胞外的蛋白，才能在甘 露糖基转移酶的作用下形成糖基化蛋白，而细胞膜，细胞质内的蛋白则 不能进行糖基化。所以依据目前现有的理论，在进行结核分枝杆菌糖蛋 白的筛选时，只选择了CFP作为研究对象，而不选择细胞的其它组份。 在生物安全3级操净台中，将50％甘油冻存的结核分枝杆菌H37Rv 菌株接种到，H11琼脂糖平板上，37℃孵箱中生长2周。挑取平板上单个菌 落接种到l 0ml 7H9液体培养基中，37℃振摇培养2周。将l 0ml菌液再转 移到1L的GAS液体培养基中。接种后的细菌于37℃孵箱中以100rpm的速 度振摇培养。约10—14天后，监测细菌培养液OD600值，当细菌OD600值达 到0．6—0．8时，取出培养瓶。4℃离心收获上述细菌， 转数3000rpm，离心 1 5mins，将沉淀的细菌再溶于1 00ml GAS培养基中(不含有土温)，然后 平均接种到104各含有1L GAS培养基的培养瓶中，继续于37℃孵箱中以 l 00rpm振摇培养2周。2周后，停止培养，取出菌液，将培养瓶静置，细菌 沉淀，用50ml吸管于操挣台中将细菌吸出，将余下的上清液经O 沉淀，用50ml吸管于操挣台中将细菌吸出，将余下的上清液经O 29m Zapcap过滤器经负压吸引过滤除菌，用3个容积为4L的高压灭菌的收集 瓶收集滤液，得到粗提的CFP。于4℃冷库中将约1 0L的CFP粗提液倒入 Amicon容器中，打开氮气罐阀门，在持续的压力作用下(最大压力不能 超过60 psi)，Amicon容器中的CFP会自动缓慢流入到过滤浓缩装置中，该 装置内的磁力搅拌棒缓慢搅动，防止有沉淀产生。此时，分子量大于3kDa 的蛋白成分得到保留，而小的分子会被滤除，使粗提的CFP得到浓缩。 大约48—72小时后，10L的CFP会浓缩到1 O．50ml左右。在此过程中，压力 保持一致，装置接口处密闭。将浓缩的CFP转移到透析袋(3kDa)中， 于4℃冷库中透析。透析液为8L的10mM的碳酸氢胺。每8h更换一次透析 液，共更换3次。采用BioRad 680微板阅读器(波长550 nm)BCA法检测蛋 白浓度。用ConA结合缓冲液将蛋白样品CFP浓度稀释到lmg／ml：ConA琼 脂糖4B树脂装柱，将10ml样品缓慢加到柱内，用5倍柱体积的ConA洗脱 液洗脱柱上结合的蛋白样品，流速为lml／min；收集洗脱部分；将收集