课件：局部给药制剂控制菌检查.ppt

阳性：10ml供试液+1ml菌液 样品：10ml供试液 阴性：10ml缓冲液 营养肉汤（亚碲酸钠）增菌液各100毫升 供试液 缓冲液 营养 肉汤 营养 肉汤 营养 肉汤 培养温度：36±1℃ 培养时间：18~24h 必要时可延至48h 阴性对照应无菌生长 增菌 增菌备料单 营养肉汤培养基100mlX2 玫瑰红钠琼脂培养基150ml 氯化钠蛋白胨水150ml 移液管1mlX5 10mlx2 试管2支 平皿x8 玻璃棒x1 100ml量筒x1 空三角瓶 营养肉汤培养基 名称 用量 作用 胨 10g 营养物质，提供碳源、氮源、维生素和生长因子 牛肉浸出粉 3g 氯化钠 5g 调节渗透压 水 1000ml 用于饱和培养基 亚碲酸盐肉汤培养基：临用前，取灭 菌的营养肉汤培养基，每100m加入新 配置的1%亚碲酸钠（鉀)l试液0.2ml， 混匀，即得。 亚碲酸钠的作用是一直其他 菌生长，起选择作用 取上述成份混合，微温溶解，调节pH 为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭 菌后为7.2±0.2,分装，灭菌。 分离培养 增菌培养液 阳性 样品 四驱划线 卵黄氯化钠琼脂平板 甘露醇琼脂平板 以接种环沾取1-2 环 培养液，划线接种 培养温度： 36±1℃ 培养时间：24~72h 分离培养备料单 平皿1x4 卵黄氯化钠琼脂培养基40ml 甘露醇氯化钠琼脂培养基40ml 卵黄氯化钠琼脂培养基： 名称 用量 用处 胨 6.0g 提供碳源、氮源、维生素和生长因子 牛肉浸出粉 1.8g 10%氯化钠卵黄液 100ml 金黄色葡萄球菌具有卵磷脂酶。可分解卵磷脂生成汝浊环 琼脂 23g 凝固剂 氯化钠 30g 具有选择和调节渗透压的作用 水 650ml 饱和培养基 除10%氯化钠卵黄液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH7.6±0.1,待冷至60℃ 以无菌操作加入10%氯化钠卵黄液，充分混匀，勿振摇，倾注平皿。10%氯化钠卵黄液的制备取新鲜鸡蛋1 个，以无菌操作取出卵黄，放入10%氯化钠溶液100ml 中，充分混匀。 甘露醇氯化钠琼脂培养基 名称 用量 作用 胨 10g 提供碳源、氮源、维生素和生长因子 牛肉浸出粉 1g 酚磺酞指示剂 2.5ml pH指示剂 琼脂 15~20g 凝固剂 甘露醇 10g D—甘露醇为可发酵的糖类 氯化钠 75g 具有选择和调节渗透压的作用 水 1000ml 饱和培养基 除甘露醇、指示液和琼脂外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH 使灭菌后为7.4±0.2，加入琼脂，加热溶化后，滤过，分装，灭菌，冷至60℃，倾注平皿。 金黄色葡萄球菌在两种选择性培养基上菌落的形态特征 培养基 菌落形态特征 卵黄氯化钠琼脂 金黄色，圆形凸起，边缘整齐，光滑湿润，外周有分解卵黄磷脂后产生的乳浊圈，菌落直径1~2cm 甘露醇氯化钠琼脂 金黄色，圆形凸起，边缘整齐，光滑湿润，外周有黄色环，菌落直径0.7~1cm 挑取疑似菌落接 种于营养琼脂斜面 于36℃培养箱培养 18~24h 取斜面培养物进行 革兰氏染色，镜检 营养 肉汤 于36℃培养箱培养 18~24h 纯培养 纯培养备料单 营养琼脂斜面10mlx4 营养琼脂培养基 名称 用量 作用 胨 10g 提供碳源、氮维生素和生长因子 牛肉浸出粉 3g 氯化钠 5 调节渗透压 水 1000ml 饱和培养基 取上述成分，混合。微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入14g琼脂，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，灭菌。 革兰氏染色、镜检 1、以接种环蘸取无菌水与洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰2~3次（载玻片不烫手）固定。 2、滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。 3、滴加碘液，媒染1min，水洗，以滤纸吸干余水。 4、滴加95%乙醇，脱色20~30s，水洗。 5、滴加沙黄染液，复染1min,待干后，镜检。 6、染色结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，球状。 生化试验 原理：血浆凝固酶是一种含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的人或兔的血浆发生凝固的酶类物质。致病性葡萄球菌大多能产生凝固酶，非致病葡萄球菌不产生此酶，试管血浆呈凝固者为阳性反应，不凝固者为阴性反应。 阳性 阴性 致病菌 血浆凝固酶 使血浆凝固 分 类 游离性凝固酶 分泌至细菌体外 被血浆中凝固酶反应因子激活，形成葡萄球菌凝血酶。 使纤维蛋白原变为纤维蛋白，导致血浆凝固。 采用试管法检测 结合型凝固酶 在菌体表面 与纤维蛋白原结合，使纤维蛋白原变为纤维蛋白。 引起细菌凝集 采用玻片法检测 操作步骤（供试液制备） 1、软膏、乳膏剂 先将已备妥的含5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯