课件：金黄色葡萄球菌检验方法.ppt

简介 金黄色葡萄球菌，也称“金葡菌”，细胞壁含90%的肽聚糖和10%的磷壁酸。其肽聚糖的网状结构比革兰氏阴性菌致密，染色时结晶紫附着后不被酒精脱色故而呈现紫色，相反，阴性菌的细胞壁肽聚糖层薄、交联度差，脂类含量高，所以紫色复合物被酒精冲掉然后附着了沙黄的红色。金黄色葡萄球菌与青霉素的发现有很大的渊源。当年弗莱明就是在他的金黄色葡萄球菌的培养皿中发现有些球菌被杀死了，于是发现了青霉素。而研究也表明青霉素只对以金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌作用明显。这也是由肽聚糖层的厚度和结构造成的。 金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点：季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化脓性感染部位，常成为污染源。 金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。 检验方法 一．材料与方法 1、材料 ①培养基：7.5%NaCl肉汤培养基，血琼脂平板培养基（按常规方法制作） ②试剂：7.5%NaCl肉汤培养基，革兰氏染色，血琼脂平板，Baird-Parker琼脂平板，生理盐水，兔血浆（1：4）， ③器材：温箱，显微镜，天平，均质器，载玻片，L型涂片棒，三角瓶，刻度吸管，平皿，试管及试管架，研磨，1ml注射器， ④实验动物：健康的小白鼠 2、方法 待检样品25g+225ml灭菌生理盐水 　　　　　　　　　　　│ 　　　　　┌─────┴─────┐ 　　　　　直接计数法 增菌培养方法 　　　　　↓　　　　　　　　　　　↓ Baird-Parker琼脂平板 7.5%NaCl肉汤培养基 ↓　　　　　　　　　　　↓ 血平板 血平板 　　　└─────┰─────┘ 　　　　　　　　　↓ ┌─────┰─────┰──────┐ ↓　　　　　↓　　　　　↓　　　　　　↓ 涂片染色镜 溶血观察　动物接种试验 血浆凝固试验 └─────┴──┯──┴──────┘ 　　　　　　　　 ↓ 报告 1、样品的采集 称取25g火腿肠，切碎搅匀（用灭菌研钵研磨），置于250ml锥形瓶中，加入225ml灭菌生理盐水，制成1：10样品混悬液，混匀后作用20分钟，随机取10ml离心。 2、增菌及分离培养 ①增菌培养方法：吸取5ml上清液，接种于7.5%NaCl肉汤培养基内，置于（37±1℃）恒温箱中培养24h，划线接种入血平板，（37±1℃）恒温箱中培养24h。 ②直接计数方法：吸取上述悬液，进行10倍递增稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液各1ml，分别加入3个Baird-Parker琼脂平板，每个平板的接种量分别为0.3ml、0.3ml、0.4ml。用灭菌L型涂布棒涂布整个平板，置于（37±1℃）恒温箱中培养24h。之后分别对3个平板上生长的周围有浑浊带的黑色菌落进行计数。转接入血平板，（37±1℃）恒温箱中培养24h。 3、涂片、染色与镜检 将纯培养的未知菌涂片，革兰氏染色，显微镜观察。 4、生化实验 ①触酶试验 在载玻片上滴1滴3%的过氧化氢，调取纯化的细菌放在过氧化氢中观察变化。30s内产生大量气泡者为阳性，不产生气泡者为阴性。 ②血浆凝固酶试验 吸取1：4新鲜兔血浆0.5ml，放入小试管中，再加入培养24h的2①中的肉汤培养液0.5ml，摇荡均匀，放入（37±1℃）恒温箱中培养，每0.5h观察一次，观察6h，检查是否出现凝固。将试管倾斜或倒置时，呈现凝块状，可判定为阳性，同时以已知阳性葡糖球菌和阴性肉汤作为对照。 5、动物感染实验 用无菌生理盐水将2①中血琼脂板上纯化的菌落洗下后，以0.5ml/只腹腔注射入小白鼠体内，同时用灭菌生理盐水注射入另外的小白鼠体内，以做对照，分别在相同条件饲养，观察其症状。对感染试验出现症状或死亡的小白鼠进行剖检，并采集病料，进行分离。 二．结果与分析 1、培养特性及形态特征 ①培养特性 在37℃条件下，需氧与厌氧培养的血液营养琼脂平板均长出光滑、湿润、隆起，约1mm大小的金黄色菌落，并且有β溶血现象。 ②镜检结果 显微镜下观察该菌为革兰氏阳性球菌，排列成葡萄串状，也有个别2个或3个球菌相连。根据菌落形态、镜检结果怀疑该菌为葡萄球菌。 2、菌落计数报告 将直接计数法试验中的3个平板中疑似黑色葡萄球菌的金黄色菌落数相加，乘以血浆凝固酶试验阳性数，除以5，在乘以稀释倍数，即为每克样品中金黄色葡萄球菌数量。 3、动物感染试验 只注