亮氨酸拉链提高小鼠血浆中剪接的凝血因子峪凝血活性.PDFVIP

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 2012, 39(12): 1220~ 1225 亮氨酸拉链提高小鼠血浆中 剪接的凝血因子 凝血活性* ** 朱甫祥 刘泽隆 缪 静 屈慧鸽 迟晓艳 ( 东大学生命科学学院，烟台264025) 摘要 培养细胞实验表明，亮氨酸拉链通过改善内含肽(intein) 的蛋白质剪接效率，提高双载体转B 区缺失型凝血因子 (BDD- F )基因细胞剪接F 蛋白的分泌量和活性 本文从C57BL/6 小鼠门静脉注射含亮氨酸拉链和 DnaB 内含肽融合的 Ssp BDD-F 的重链和轻链基因双表达载体，48 h 后，检测到血浆的重链分泌量和F 活性分别为(298 依67) 滋g/L 和(1.15 依 0.29) U/mL ，明显高于不含亮氨酸拉链的双载体转BDD-F 基因对照小鼠(( 179 59) g/L 和(0.58 0.19) U/mL) 结果表明， 依 滋 依 亮氨酸拉链通过改善蛋白质反式剪接，提高基于蛋白质剪接的双载体转BDD-F 基因小鼠血浆的凝血活性，为进一步双腺 相关病毒(AAV)载体转BDD-F 基因的甲型血友病基因治疗研究提供了依据 关键词 B 区缺失型凝血 因子，亮氨酸拉链，双载体转基因，蛋白质反式剪接，血浆凝血活性 学科分类号 Q5 ，Q7 DOI: 10.3724/SP.J.1206.20 12.00202 双载体转人工断裂的凝血因子 (F )重链和 亮氨酸拉链可提高小鼠血浆的重链分泌水平和F 轻链基因是克服腺相 病毒(AAV)载体容量限制、 凝血活性，为进一步运用双AAV 载体的甲型血友 进行甲型血友病基因治疗研究的常用方法[1-2] 但 病基因治疗研究提供了依据 重链(HC) 固有的低分泌性使重链淤积胞内，影响细 1 材料和方法 [3] 胞的稳定性，甚至诱导细胞凋亡 ；且血浆中过多 的轻链(LC)可能引起机体的免疫反应 我们运用蛋 1援1 材料 白质反式剪接的双载体转F 基因研究表明，重、 含有人BDD-F 重链、轻链与split Ssp DnaB 轻链 细胞内、外均可通过内含肽(intein) 的蛋白质 内含肽的融合基因表达载体 pCMV-HCIntN、 反式剪接作用，产生肽键连接的活性F 蛋白，且 pCMV-IntCLC 为我们以前工作中构建[4] 高保真 轻链表现出对重链的顺式促分泌作用[4-5] Pfu Turbo DNA 聚合酶购自Stratagene 公司；DNA 蛋白质剪接为包埋于宿主蛋白的内含肽自催化 连接酶试剂盒购自New England Biolabs 公司；Spin [6] Miniprep Kit 和HiSpeed Plasmid Midi Kit 为Qiagen 去除内含肽并伴随宿主蛋白肽键连接的反应 蛋 白质剪接分为顺式剪接和反式剪接两种，基于内含 公司产品；重组F 为BioChain 公司产品；人F 肽双载体转基因运用的是分子间的反式剪接，虽然 重链单抗 ESH-5 和