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基于代谢途径研究多杀菌素高产菌株选育 摘要：通过对刺糖多葩菌(Saccharopolyspora spinosa)多杀菌素代谢合成途径的分析，提出了一种代谢 控制育种策略和提高诱变筛选效率的方法。以刺糖多鞄菌 QYLZ 88912菌株为出发菌株，选择不同照射时间分别对其进 行紫外线照射处理，然后用含有不同抗性物质的摇瓶对诱变 菌进行初筛，最终筛选出了1株高产多杀菌素的多抗性菌株 SG+St+Er+-088o该菌株同时具有磺胺肌、链霉素和红霉素 抗性，摇瓶发酵试验表明，发酵7 d多杀菌素浓度可以达 到1 132.60 mg/L,较出发菌株提髙了 85.4%,经传代试验 证明此菌株高产遗传特性稳定。 关键词：代谢途径；代谢控制育种；多杀菌素；菌落形 中图分类号：Q819； Q815文献标识码：A文章编号: 0439-8114 (2013) 10-2309-06 当前中国农药的应用可以简单地总结为农药品种多、质 量低、用量大、效率低、农产品中残留量高，对环境污染严 重[1],因此开发高效绿色的新型农药显得尤为重要。多杀 菌素(Spinosad )又称刺糖菌素，是由刺糖多砲菌 (Saccharopolyspora spinosa)通过有氧发酵聚酮合成途 径合成的大环内酯类抗生素，兼有化学农药的速效性和生物 农药的安全性，不会对环境产生污染，对鱼、畜、禽安全系 数高。多杀菌素作为一种绿色生物农药，其具有杀虫谱广、 作用方式独特、杀虫活性高、半衰期短、残留低、无抗药性、 对人畜无害、环境污染少等优点[2],是一种具有触杀及胃 毒毒性的新型微生物源杀虫剂，于1999年获得美国“总统 绿色化学品挑战奖” [3],在农牧业生产中具有广阔的应用 前景，该类产品的开发也具有良好的经济效益和社会效益。 刺糖多胞菌属于糖多胞菌属(Saccharopolyspora),是 迄今发现的惟一可以通过好氧发酵产生多杀菌素的菌株。目 前国外多杀菌素的研究领域已延伸到开发杀虫活性更高、生 物安全性更好的衍生物上。国内对发酵生产多杀菌素的研究 起步晩，最近几年也取得了很大的进展，但较国外研究水平 还有很大的差距[4]。国内报道多杀菌素高产菌株较高生产 水平为800?1 260 mg/L[5, 6],而国外早在10多年前就实 现了工业化生产。多杀菌素的制备方法主要为微生物液体发 酵合成，生物合成多杀菌素具有突出的优点，工艺条件较易 控制、产品质量稳定、提取较为方便，但微生物液态发酵生 产多杀菌素产量很低，主要问题是缺乏高产菌株，以致影响 了该物质的应用。因此筛选高产菌株，为中国农药领域开辟 新型绿色产品，对农牧业生产具有重要的意义。试验运用理 性筛选思路和高效诱变方法，筛得高产菌株，并对其进行生 物化学和遗传学分析。 1材料与方法 1.1供试菌种 刺糖多砲菌QYLZ 88912菌株，由天津北洋百川生物技 术有限公司保藏。 1.2培养基 保藏分离培养基：可溶性淀粉20 g/L,葡萄糖5 g/L, 酵母提取物3 g/L,玉米浆10 g/L, MgS04?7H20 2 g/L, 琼脂20 g/L, pH 6. 5?6. 7 , 121 °C高压蒸汽灭菌20 mino 种子培养基：可溶性淀粉20 g/L,葡萄糖5 g/L,酵母 提取物 3 g/L,玉米浆 10 g/L, MgS04 ? 7H20 2 g/L, pH 6. 5? 6. 7, 121 °C高压蒸汽灭菌20 min。 发酵培养基：葡萄糖40 g/L,可溶性淀粉30 g/L,玉 米浸液15 g/L,棉子浓缩粉20 g/L,酵母粉20 g/L,碳 酸钙3 g/L, pH 7. 0?7. 2 , 121 °C高压蒸汽灭菌30 min。 1.3主要试剂 试验所用主要试剂情况见表1。 1.4菌株QYLZ 88912对所用抗性物质的耐受上限试验 将出发菌株的砲子悬浮液涂布于含有不同抗性物质、不 同设计水平的平板，每个处理做3个平行，在相对湿度70%? 80%、29 °C的培养箱中培养7?9 d,观察抗性平板的菌株生 长情况，确定出发菌株对所用抗性物质的致死（耐受）上限。 1.5菌株的诱变处理 1.5. 1胞子悬浮液的制备 选择生长良好的多杀菌素出 发菌株QYLZ 88912斜面菌种，用无菌生理盐水将其胞子洗 下，转入装有玻璃珠的无菌三角瓶中振荡30 min,使鞄子充 分分散，用脱脂棉过滤砲子悬浮液，并调节胞子悬浮液浓度 为106?107个/mL,备用。 1.5.2致死率测定 取处理好的胞子悬浮液于30 W紫外 灯下30 cm处分别照射不同的时间进行诱变处理，将诱变后 的胞子悬浮液梯度稀释涂于保藏分离培养基平板，于29 °C 避光培养7?9 d,计算致死率。 6分析方法 6. 1色谱分析高效液相色谱仪Agilent t ech