FluorChemQ和ECLPlexTM高灵敏的定量分析多色荧光Western成像.PDFVIP

应用手册 117 FluorChem® Q和ECL PlexTM ： 高灵敏的定量分析多色荧光 Western 成像 多色荧光检测可以在同一张Western膜上同时 检测、分析多种蛋白。这种检测方法无需蛋白膜剥 离和重杂交，而是通过引入内参来实现对蛋白质的 定量分析。FluorChem® Q灵敏度高，可捕获高质 量的多色荧光Western 图像。本文通过采用ECL PlexTM 标 记 的 Western 实 验 ， 详 细 阐 述 了 图 1. 荧光 Western 检测。三种一抗分别与同一 FluorChem® Q可达到的灵敏度和动态范围，展示 张膜上的三种抗原结合（三角形）。每种一抗都与 了该系统在多色Western方面的出色表现。 一种荧光标记二抗结合，三种二抗分别用 Cy5 （红 色），Cy3 （绿色），Cy2 （蓝色）三种Cy 染料标记。 简介 多重分析或多荧光通道成像，可在同一个微阵 ECL PlexTM Western Blotting Detection System 列上同时分析多种 RNA 样品，或在荧光显微镜下 （GE Healthcare ）采用CyDey结合二抗。这种抗体 同时分析位于同一个细胞中的多种抗原。近年来， 的直接荧光检测法灵敏度高，线性范围好，动态范 这种技术开始应用于 Western blotting ，并成为蛋白 围宽（2 ）。此外，直接荧光检测具有多种应用，通 质研究的有力工具。 过采用不同荧光标记的二抗，可以在同一张杂交膜 化学发光法是 Western blotting 最常用到的方 上同时检测多种蛋白（图 1）。所选用的每种染料都 法，同时也是一种非常灵敏的蛋白质检测技术（1）。 具有独特的光谱特性，通过选择合适的激发、发射 然而，这种方法在多重蛋白的研究方面有局限性。 波长，这些染料可以被分别激发成像。 如果目标蛋白有两种，而且大小相似，电泳后在胶 FluorChem® Q 成像系统专为荧光标记，多色 上的位置相互靠近，例如蛋白的磷酸化异构体，这 Western 成像设计，可获取高质量的图像。 种情况下每次只能鉴别其中一种蛋白。每研究一种 FluorChem® Q 系统配有三个激发光源和三个发射 蛋白，就必须进行一次剥离和重杂交，这样不仅费 滤光片，构成三个独特的光谱检测通道，适用于大 时费力，而且极易造成蛋白质丢失。也可以进行双 多常用的荧光试剂。FluorChem® Q 系统对ECL 杂交，但是会浪费珍贵样品。 PlexTM体系中用到的Cy2、Cy3 和Cy5 染料激发、发 当对多个样品蛋白进行定量分析时，会用到管 射光谱的兼容性如表 1 所示。 家或者参比蛋白来消除凝胶上样差别。化学发光 对于进行定量分析的荧光图像，拥有宽的动态 Western blot 实验中，通常需要剥离和重杂交，除非 范围是十分重要的。而宽的动态范围是与高灵敏度 用作参比的蛋白与目标蛋白有显著的大小差异。在 和低背景息息相关的。FluorChem® Q 具有高能量的 化学发光 blot 中，如果管家蛋白和目标蛋白同时杂 激发光源，均一的激发视野，保证整个印迹成像的 交，而这两种蛋白含量有显著差别，那么这两种蛋 一致性。420 万像素，Peltier 制冷 CCD，获取高分 白的信号强度也将会有相差很