qRT-PCR原理与应用-早期科普.pdf

qRT-PCR原理 从PCR到qPCR qPCR原理 Taqman探针 ：探针两端分别接荧光基团 与荧光淬灭基团,PCR中Taq酶切开探针 ， 荧光标记 分离荧光基团，使之荧光不被淬灭 染料荧光 ：SYBR染料 ，结合DNA双螺旋大 沟发荧光，与单链不结合 扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数 Ct值 （Cycle Threshold）。C代表Cycle，T代表Threshold。简单讲，Ct值 就是qPCR中起始模板扩增达到一定产物量时，所对应的循环数。 模板浓度与Ct值关系 线性关系 1 . 模 板 制 备 2 . 引 物 检 验 qRT-PCR实验 3 . 定 量 检 测 4 . 结 果 分 析 模板制备RNA - cDNA RNA提取 Trizol法 （异硫氰酸胍），盐酸胍 ，CTAB法 ··· ··· 裂解材料 核酸分离 沉淀、纯化 mRNA/ Lnc miR特异性序列+茎环结构，每 个 目标序列需要逆转录一次 5’-端引物在逆转 RNA逆转录 利用ploy A 随机 引物 添加ploy A 茎环法 录与qPCR间通用， 一步到位 ，无特异性逆转录全部RNA为cDNA 3’-端随机 miR 电泳 光度 模板质量评价 梯度模板下qPCR扩增曲线 引物设计与检验 qPCR引物设计原则 特异性，二级结构，长度，GC含量，Tm值 ··· ··· 核心原则 ：高特异性+高扩增效率 引物质量评价：评价 “高效+特异” 软件打分 PCR验证 qPCR扩增曲线+融解 曲线 定量检测 程序设置与普通PCR无异，但产物长度较小，可使用两步法 （退火延伸 qPCR程序 同时完成）替代三步法，同时需要增加荧光采样点。 也可以使用一步法qRT -PCR ：使用 目标序列特异性引物，同时完成逆 转录与定量。 荧光值到模板量 结果与图片 绝对定量-标准 曲线 相对定量-ΔΔCt法 标准品 数据分析 梯度稀释 内参基 因 PCR-Ct-