qRT-PCR原理与应用-早期科普.pptxVIP

qRT-PCR原理 从PCR到qPCR qPCR原理 模板浓度与Ct值关系 荧光标记 Ct值 Taqman探针：探针两端分别接荧光基团与荧光淬灭基团,PCR中Taq酶切开探针，分离荧光基团，使之荧光不被淬灭 染料荧光：SYBR染料，结合DNA双螺旋大沟发荧光，与单链不结合 扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数（Cycle Threshold）。C代表Cycle，T代表Threshold。简单讲，Ct值就是qPCR中起始模板扩增达到一定产物量时，所对应的循环数。 线性关系 1.模板制备 2.引物检验 3.定量检测 4.结果分析 qRT-PCR实验 模板制备RNA-cDNA 模板质量评价 RNA提取 RNA逆转录 Trizol法（异硫氰酸胍），盐酸胍，CTAB法 ··· ··· 裂解材料 核酸分离 沉淀、纯化 光度 电泳 利用ploy A 随机引物 梯度模板下qPCR扩增曲线 mRNA/Lnc 添加ploy A 茎环法 miR 一步到位，无特异性逆转录全部RNA为cDNA miR特异性序列+茎环结构，每个目标序列需要逆转录一次 5’-端引物在逆转录与qPCR间通用，3’-端随机 引物设计与检验 qPCR引物设计原则 引物质量评价：评价“高效+特异” 特异性，二级结构，长度，GC含量，Tm值 ··· ··· 核心原则：高特异性+高扩增效率 软件打分 PCR验证 qPCR扩增曲线+融解曲线 定量检测 qPCR程序 荧光值到模板量 程序设置与普通PCR无异，但产物长度较小，可使用两步法（退火延伸同时完成）替代三步法，同时需要增加荧光采样点。 也可以使用一步法qRT-PCR：使用目标序列特异性引物，同时完成逆转录与定量。 结果与图片 结果图片展示 数据分析 绝对定量-标准曲线 相对定量-ΔΔCt法 标准品 梯度稀释 PCR-Ct-扩增曲线 模板浓度C0-Ct标曲 内参基因 扩增曲线 Δ数学关系 扩增与融解曲线 表达量柱状图