朱小琼-中国农业大学植物保护学院.DOCVIP

PAGE PAGE 1 中国农业大学 本科生“URP”立项申请书 项目名称 葡萄座腔菌效应基因的敲除及功能 申 请 人 朱小琼 工作单位 植物保护学院 联系电话 电子信箱 mycolozhu@cau.edu.cn 填表日期 2017年4月13日 中国农业大学教务处制 项目名称 葡萄座腔菌效应基因的敲除及功能 项目起止时间 2017年4月—2018年4月 项目申请人情况 姓名 朱小琼 性别 女 出生日期 1978年7月 最后学历与学位 博士研究生 专业技术职务 讲师 从事专业 植物病理 项目概况 轮纹病是我国苹果生产中发生范围广、危害大的一种重要病害。该病不但引起生产中及储藏期的果实腐烂，造成严重产量损失，而且危害苹果枝干，形成轮纹病瘤或者溃疡造成枝干枯死。苹果实施套袋栽培措施后，枝干轮纹病逐年加重，成为目前苹果生产中最重要的病害之一。由于木质部的阻碍作用，即使是具有良好内吸作用的杀菌剂依然不能充分渗透到苹果枝干内部抑制病菌。因此，其防治效果受到严重的限制。 苹果轮纹病的病原是葡萄座腔菌（Botryosphaeria spp.），该病原的致病机制缺乏系统的研究。在病原物与植物互作的过程中，病原物需要突破植物的防御系统才能真正实现致病。许多植物病原细菌通过抑制由病程相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）介导的抗病反应（PAMP-triggered immunity，PTI)或效应蛋白介导的抗病反应（effectors-triggered immunity，ETI)，最终达到成功侵染寄主植物的目的。研究表明，植物病原细菌、卵菌、真菌及线虫在侵染植物的过程中都会产生功能多样的效应蛋白，干扰寄主植物细胞正常的生理功能和防御反应，包括形成胼胝体、调节植物防御相关基因转录、失活植物产生的蛋白酶、阻断激活植物识别受体的相关信号通路、抑制植物的防卫反应或直接杀死植物细胞，最终实现病菌的侵染与扩展。 课题组在前期工作中对从全基因组序列中预测到的300多个效应子进行研究，通过农杆菌介导的在本生烟中瞬时表达的方法筛选获得了100多个候选效应子，它们可以抑制由Bax诱导的烟草细胞死亡，表明这些基因很可能作为效应子在病菌致病过程中发挥重要作用。本研究拟在这些研究基础上，通过同源重组的方法，获得效应基因敲除转化体，测试转化子在病菌生长发育和致病过程中的作用。这些结果将为研究苹果轮纹病菌效应子的功能提供材料和基础。 实施计划及方案(明确各个环节对培养学生创新能力的具体思路及考核办法) 同源重组片段的获得 针对目的效应基因左右同源臂及潮霉素抗性标记设计引物； 利用Double-joint PCR方法扩增获得标记片段； 连接T载体； 转化大肠杆菌； 测序验证同源重组片段是否正确。 该环节可培养学生设计引物的能力，掌握Double-joint PCR、电泳、核酸定量、连接、转化等基本的实验方法。 考核方法：获得正确的同源重组片段 转化葡萄座腔菌 制备葡萄座腔菌的原生质体； 运用PEG介导的方法将1中获得的同源重组片段转化到原生质体中； 挑取转化子进行PCR验证 该环节训练学生制备真菌的原生质体、真菌转化及转化子的PCR验证等操作的能力。 考核方法：获得经PCR验证，正确敲除目的基因的转化子 转化子特性测试 每个基因选择3-5个敲除转化子，测试比较它们在菌落形态、生长速率、产孢量、孢子萌发等方面与野生型菌株的差异； 测试比较转化子对苹果叶片/果实的致病性。 该环节培养学生观察真菌生物学特性及致病性的能力。 考核方法：获得与野生型菌株相比有显著差异的转化子 三、项目实施的基础和条件 课题组已经筛选获得了能够抑制Bax诱导的烟草细胞坏死的候选效应子，目前正在进行同源重组敲除效应基因并对功能进行分析。课题组具备酶切、连接、转化等相关实验的技术和硬件设备，为本项目的开展提供了基础和保障。 四、学生提交的成果 结题报告； 详细、完整、清晰的试验记录； 五、经费预算 申请经费2000元，主要用于购买实验相关试剂及耗材。 六、学院URP领导小组意见 签字 （盖章） 年 月 日