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实用细胞培养技术  ◆ 在细胞培养中注意的一些问题 ◆ 细胞培养的实验程序 ◆ 细胞的复苏 ◆ 细胞的计数 ◆ 细胞(贴壁)的传代培养? ◆ 细胞的冻存 ◆ 悬浮细胞的培养方法 在细胞培养中注意的一些问题 环 境 由于体外培养细胞没有抗感染能力，若实验者粗心大意，技术操作不规范，也会导致污染。因而，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠，特别是实验环境更为重要。 ★ 超净工作台 台面每次实验前要用 75％酒精擦洗，然后紫外线消毒30 min。消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线，降低消毒效果。一些操作用具如移液器、废液缸。污物盒、试管架等用75％酒精擦洗后置于台内同时紫外线照射消毒。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线。 2. 培养前准备 在开始实验前要制定好详细的实验计划和操作程序，有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置到培养室、超净台内，然后开始消毒。这样可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。 3. 培养条件 ★ 气体环境：95％空气加5％CO2混和气体 环境中。 ★ PH值：7.2～7.4 ★ 温度：37℃ 培养实验用品的前期处理 1.清洗和浸泡: (1)玻璃器皿:新的玻璃器皿在生产过程中常使玻璃表面呈碱性，并带有一些如铅和砷等对细胞有毒的物质，使用前必须彻底清洗。首先用自来水初步刷洗，5％稀盐酸溶液中浸泡过夜。然后用流水彻底冲洗3-5遍，单蒸馏水漂洗3遍，三（双）蒸水漂洗2遍，烘干备用。  拧松一些，放入铝盒内（或用牛皮纸包装）外层用纸包装备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧；胶塞的处理：按常规冲洗干净烘干后，用2％氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞要置入单蒸水中浸泡，再用沸水处理30钟），自来水洗净，烘干然后再泡入1％稀盐酸液中30分钟，用自来水彻底冲洗3-5遍，蒸馏水漂洗3遍，三（双）蒸漂洗2遍，烘干备用。 2.包装： 在消毒前必须进行严格包装，以便消毒及储存，防止落入灰尘及消毒后再次被污染。包装纸（盒）表面用油性记号笔标明物品名称、消毒日期等。 （1）消毒灭菌的方法 : ★ 物理方法: 湿热（高压蒸汽）、干热、紫外线照射线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或去除微生物.  ★ 化学方法:使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。 (2)消毒灭菌的时间： ★ 干热消毒：一般在烤箱中进行，需加温到 160℃，保持90～120 min方能杀死芽孢。消毒完毕后不可马上将烤箱门打开，以免冷空气突然进入，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。 ◆ 一般物品：布类、金属器械、玻璃器皿等消毒的要求是 15磅20 min；常规使用液体：消毒 15磅 15 min 。橡胶和塑料用品 ：如滤器、EP管、离心管等高压10磅15 min。 ★ 紫外线消毒：主要用于实验室房间里的空气、操作 台表面及桌椅等消毒。时间为30min－2h左右。 ★ 过滤除菌消毒：适用于组织细胞培养使用的液体 如血清、合成培养液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等。 ★ EDTA液：常用浓度为 0．02％，配制时采用无Ca2+、Mg2+平衡盐液溶解，高压灭菌后即可使用。 ★ 胰蛋白酶EDTA－Na2:需过滤除菌。胰蛋白酶和EDTANa2联合使用可提高消化率，但需注意EDTA不能被血清中和，消化后要彻底清洗，否则细胞易脱壁。 ★ 胶原酶：适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。可用BSS或含血清的培养液配制，这样实验操作简便同时提高细胞成活率。  但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。胶原酶的常用剂量为 200 U／ml（约为 lmg／ml）或 0．03％～0．3％。(4)培养基（液）过滤除菌 常用0．22pm微孔滤膜。 （8）3% L-谷氨酰胺：可作为细胞能量来源，使用量1％。但其在溶液中极不稳定，需重新加入。（9）丙酮酸钠、葡萄糖：是属碳水化合物的成分，是细胞生命的能量来源。 （10）抗生素：最终浓度为青霉素 100 U／ml，链霉素100U／ml（青霉素为80万U／瓶，将其溶解于4ml三蒸水中，每升培养液中加入0.5ml；链霉素为100万U／瓶，将其溶解在5ml三蒸水中，每升培养液加0.5ml）。 （11）细胞生长液：是用以维持细胞生长增殖的液体。其是配方：基础培养基 80％～90％ 血清 10％～20％ 双抗