傅里叶红外光谱成像技术.pptx

;引言;引言;红外光谱用于生物物理学和生物化学进行结构分析已有大半个世纪。该方法提供了重要的结构信息，例如组织的组成，蛋白质二级结构和相互作用，DNA 构象和结构转变，脂质构象的排序和相行为等。傅里叶变换红外（fourier transform infrared ，FTIR）光谱技术则是在20世纪80年代后期兴起，并在生物医学研究中发挥着越来越重要的作用。;引言;目前世界著名的红外光谱学显微成像系统的生产公司包括Bio‐Rad （现在是Digilab／Varian） ， Perkin Elmer （PE） ，Thermo‐Fisher Nicoli ，Bruker 等。这些红外光谱显微成像系统基本上是由红外光谱仪和红外显微镜系统两大部分组成。仅以最具代表性的PE 公司的Spotlight 300 系统为例，描述红外光谱学显微成像系统的原理和构成。;该系统是由一个红外光谱仪（Spectrum One）耦合一个Spotlight 300 显微镜装置。系统内部包含一个16 × 1 单元（400 μm × 25 μm）HgCdTe （MCT） 线性阵列探测器（如引言中所述）和一个单点（100 μm × 100 μm ）MCT 探测器，并以液氮置于Dewar 瓶中进行冷却。这两个探测器均是在液氮温度下以光敏（光电导）模式工作。二者所探测的最低光谱范围可从720 cm － １ （后者甚至可更低一些）开始。;显微装置中配以物镜和聚光镜（condenser）实现成像的６× 放大，数值孔径为０.５８ 。【特定的光学设计允许样品区域在探测器单元上实现１ ∶ １ 和４ ∶ １ 成像，从而达到２５ × ２５ 和６.２５ μm × ６.２５ μm 正常空间分辨率（实际的空间分辨率是和波长相关的，并由衍射限来决定的） 。光谱可以以快速扫描的模式（最大速率８０ pixels／s）进行采集。】可见光成像（视觉影像Visual image）的收集则通过一个CCD 相机结合计算机控制（亦可手动操作）的显微镜样品台的运动来最终实现。可见光成像的收集是在白光LED 的照射下“拼接”而成。而后在可见光成像区域内选择感兴趣的区域进行红外光谱成像。因为系统集成阵列探测器和运动样品台，所以红外光谱成像数据采集速度较快。具体速度还与光谱分辨率及空间分辨率有关，分辨率越高则采集时间越长。;引言;根据样品的特点、性质和测量要求选择测量或成像模式，通常有反射??式和透射模式。针对不同的成像模式，所采用的载玻片也截然不同。对于透射模式，因为是实现透射测量，所采用的载玻片多是在红外波段几乎全透的BaF２ 晶片，从而可最大限度地减少客观条件对实验结果的影响。因为透射模式可提供最好的信噪比和较好的光谱质量，但是光谱强度却容易受到样品厚度和样品吸光度的影响，所以更适用于测量透光性较好的样品。;成像模式选择之后，将样品置于红外显微镜的样品台上，进行Z 轴方向的上下调节从而可实现LED 白光和入射红外光有效聚焦到待测样品位置。在清晰聚焦之后，调节（移动）样品台来确定可见光成像区域。在可见光成像的基础上选择ROI（region of interest）进行红外光谱显微成像。;通过样品台的精确移动和探测器对样品的同步扫描和计算机数据处理，获得ROI 的每个像素的XY 坐标和红外光谱。这些探测器测量目标范围内全波段光谱的平均吸收率（或透射率） ，并采用一定的颜色（范围）来表示，即（Artifact），从而ROI 显示以彩色图像。在任意像素所对应的红外光谱上选择某特征谱带，即可衍生出该特征谱带所对应的特征基团或该基团所代表的某特征成分在样品的ROI 内的分布情况，此即成分图像（Chemical Image） 。从而可形象直观的分析样品组分、结构特征、特征基团的空间分布及其变化等。;引言;传统红外光谱学可研究鉴别骨中羟磷灰石的存在和定量研究骨中取代基，譬如碳酸盐和酸式磷酸盐的存在，可提供均匀分布的组织中的晶体尺寸和完整度，有利于研究骨质疏松性骨折。但是主要是针对均匀骨质。FTIRI 技术的出现则有利于进一步研究这些硬组织当中的空间异质性，即其较高的空间分辨率和丰富的光谱信息有利于研究和表征从硬组织的表面到内部的结构和成分分布差别。尽管组织化学和X 射线显微照相技术可观察到这些空间变化，但是FTIRI 技术则可提供更精确的定量描述。因此骨的异质性或不均匀性等特性决定了FTIRI 适宜进行和年龄、位置变化等相关的空间分辨的研究，从而可定量判定骨的空间含量或空间差异 、成分和性质以及饮食、环境和具体的蛋白质（发生基因突变等）的影响，同时也为生物医学的研究的开辟了一个新的研究领域并提出了治疗依据。;;成骨不全（osteogenesis imperfecta） ，也称骨脆症，是一种具有罕见遗传性的易碎骨病。此病的患