第五章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达.pptx

第五章 基因在大肠杆菌、酵 母中的高效的表达;第一节基因的表达系统与表达策略;宿主细胞的选择;二 宿主细胞分为两大类;大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系;酵 母;基因表达的基本过程;Transcription(转录): making an RNA copy of a DNA sequence . RNA polymerase opens the part of the DNA to be transcribed. Only one strand of DNA (the template strand, antisense strand) is transcribed. ;有效转录的基本条件;1 具备起始密码子 2 具备终止密码子 3 具有正确的阅读框;根据表达蛋白用途选择基因的表达策略;真核基因表达的特点;原核体系中表达真核基因的困难;⑴将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列的下游，使得真核基因处于原核调控体系中。 ⑵采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的基因，这样就解决了原核细胞没有RNA剪接功能的问题。 ⑶构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降解，最后可以将融合多肽切除。;;⑴启动子 要求是：①强启动子②是诱导性的，如热诱导和化学诱导 ⑵转录终止子 使转录终止，增强mRNA的稳定性，提高蛋白质产物的表达水平。尤其是将两个终止子串联，转录终止功能更强。 ⑶核糖体结合位点 在转录起始位点下游的一段DNA序列（SD，5’AGGAGG3’） (4)筛选标记基因 (5)密码子的选择 ;常见的大肠杆菌表达系统;影响克隆基因表达效率的因素;５’--AGGAGGUXXXAUG--- mRNA ３’AUUCCUCCACUAG-----　16S rRNA3’ 末端;; ;蛋白质的分泌型表达;蛋白质的包含体形式表达;减少包含体形成的策略;有效、理想的复性方法应具备一下几个特点 ;第三节 基因在酵母中的高效表达;甲醇酵母表达系统;甲醇酵母表达系统的优点;影响目的基因在甲醇酵母中表达的因素