不同剂量脂多糖预处理对哮喘小鼠肺部炎症的影响的研究.docxVIP

不同剂量脂多糖预处理对哮喘小鼠肺部炎 症的影响的研究 .李鸿佯干淑娟李艳丽董高 ?【摘要】’目的：研究不石剂量脂多糖(LPS)通过诱导肺泡巨噬 细胞(AM) Toll样受体4 (TLR4)的高表达，探讨其对哮喘小鼠肺 部炎症的影响。方法：BALB/c小鼠随机分为哮喘模型组(OVA) A, 低剂量LPS处理组(0.1 mg/L LPS+OVA) B,高剂量LPS处理组 (100 mg/L LPS+OVA) C,对照组(生理盐水)Do用卵白蛋白 (OVA)致敏与激发建立小鼠哮喘模型；酶联免疫吸附试验 (ELISA)检测各组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)上清中IL 4、IL 5、IL 13和IFN Y的含量，实时荧光定量PCR法测 定AM的TLR4的表达，光镜观察肺组织病理变化。结果：与A组 相比较，B组BALF上清中IL 4、IL 5和IL 13的水平显著 增高(Plt;0.05),而IFN Y差异无统计学意义(Pgt;0?05) , C 组BALF上清中IL 4、IL 5和IL 13的水平显著降低，IFN 丫显著增高(Plt;0.05);与A组相比，B组与C组AM的 TLR4mRNA表达均明显增高(Plt;0.05)，两组间差异无统计学意 义；光镜下，A组支气管黏膜下水肿，黏液腺增生，可见大量以嗜酸 性粒细胞为主的炎症细胞浸润。B组与C组上述情况未见减轻，并 岀现肺泡腔及间质充血，中性粒细胞等大量的炎症细胞浸润，D组管 腔内无黏液栓，气道周围无炎症细胞浸润，肺泡壁结构完整。结论: 低剂量LPS(0.1 mg/L)诱导哮喘小鼠AM的TLR4高表达，使肺部炎 症加重，而高剂量LPS(100 mg/L)可能会减轻变态反应症状。 【关键词】 肺泡巨噬细胞；脂多糖;Toll样受体4;支气管哮喘 支气管哮喘(简称哮喘)是一种以嗜酸性粒细胞为主的众多炎症细胞 和炎症因子参与的慢性气道炎症性疾病［1］,其发病率呈逐年上升 趋势，室内灰尘，革兰阴性杆菌的内毒素等在哮喘气道炎症中的作用 存在很大的争议。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌的一类重要的 病原体微生物成分，研究发现，LPS浓度可影响Thl/Th2炎症反应。 高水平LPS可使具有抗原特异性的Thl反应增强，低剂量LPS可使 Th2敏感性增高，提示LPS可能在过敏性炎症反应中具有独特的双 向作用［2］。TLR4是LPS的主要模式识别受体，TLR4结合LPS 等病原体相关分子模式后通过释放细胞因子可促进Thl细胞分化, 从而可能在哮喘免疫和宿主保护中起重要作用，但目前尚没有足够 证据证明TLR4能直接识别Th2型免疫应答。我们试图运用不同剂 量LPS干预小鼠哮喘模型，研究LPS诱导AM表面TLR4激活机制, 探讨TLR4激活在哮喘发病机制中的信号转导途径，进一步明确其在 哮喘小鼠气道炎症加重的机制中的作用。 1材料和方法 1」材料 鸡卵蛋白(OVA, GradeV,纯度＞98%, Sigma),超纯脂 多糖(ultra pure LPS, E. coli Olli: B4, Sigma), BALB/c 小鼠(6?8 周龄，雌性)由山东大学试验动物中心提供，小鼠IFN 丫和IL 4 ELISA试剂盒购自深圳晶美生物公司，小鼠IL 5和IL 13 ELISA试剂盒购自上海西唐生物公司，总RNA抽提与纯化试剂盒购 自Roche公司，SYBR Green I购自Roche公司，Spector I型酶标 分析仪(美国)。 1.2方法 1.2.1动物分组与模型建立 将40只雌性BALB/c小鼠随机分为4 组，每组10只，A组为哮喘组，B组为低剂量LPS处理组(0」mg/L LPS+OVA) , C 组为高剂量 LPS 处理组(100 mg/L LPS+OVA) , D 组为生理盐水对照组。A组于笫1(实验开始当天)、8 d分别腹腔内 注射 OVA 混悬液每次 50 u g, [OVA/AL(OH)3 为 10 mg/g],第 15 天将小鼠置于白制的有机玻璃盒中，给予雾化吸入OVA(10 g/L OVA/PBS),每天30 min,连续1周。D组致敏与激发均以生理盐水 代替OVA。B组和C组分别在致敏阶段每隔2 d腹腔注射1 mL含 0.1、100 ug E. coli LPS,激发阶段在每次激发前1 h腹腔注射相 同剂量浓度E?coli LPSo各组小鼠在末次激发24 h以后处死。 BALF标本的收集对小鼠行气管插管，在左主支气管处结扎 左肺，用3mL冰磷酸盐缓冲盐水(PBS)分3次灌洗右肺，回收液体量 gt;80%为合格,约 2.5 mL/鼠，1 000 r/min,离心 10 min, 4°C 离心, 收取各组细胞上清液,-80°C保存待测。 AM的分离与培养BALF离心后沉淀用生理盐水3 mL