LC系统扩散对单抗聚集体和片段SEC分析的影响基于方法-Waters.PDFVIP

[ 应用纪要 ] LC系统扩散对单抗聚集体和片段SEC分析的影响：基于方法选择最佳 色谱柱规格 Stephan M. Koza、Corey Reed和Weibin Chen 沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德) 应用优势 简介 ■■ 教学式系统展示LC系统扩散对mAb的SEC 过去，体积排阻色谱(SEC)是评估重组蛋白生物治疗药物中非共价蛋白质聚集体 分离的影响 (高分子量物质[HMWS])时应用最广泛的方法1 。但近年来，由于SEC色谱柱和LC ■■ 指导用户根据所使用的LC系统和分析方法 系统的性能提升，使用SEC对这些样品中的蛋白质片段(低分子量物质[LMWS]) 要求(包括分离度、灵敏度、重现性和可转换 在非变性的条件下进行分析的方法也越来越受到人们的关注。其中最受关注的， 是针对铰链区水解降解所产生IgG单克隆抗体(mAb)片段的分析方法2。相较于将 性)选择最佳的SEC色谱柱配置 单体(约150 KDa)与二聚体和更高分子量形式HMWS(≥300 KDa)分离的传统分 ■■ 展示ACQUITY™ UPLC™ H-Class Bio和 离方法，LMWS片段(分子量为mAb单体分子量三分之二(约100 KDa)的mAb主 ACQUITY Arc™ Bio系统的SEC分离性能 要形式)的分离可能更具挑战性。这是由于LMWS与单体的大小 (流体动力学半径)相比于单体与HMWS蛋白质的大小更加接近。由于蛋白质洗 脱顺序中低浓度LMWS峰作为主(单体)峰上的拖尾肩峰洗脱，使分离难度进一 步增加。 虽然使用粒径为亚2 µm的SEC色谱柱能够提高效率，从而提高HMWS和LMWS 的分析通量，但由于色谱柱硬件和填料的限制，这些高柱效SEC颗粒仅适用于内 径为4.6 mm或更小的色谱柱。使用HPLC色谱系统时，通常因为SEC粒径为3 µm 及以上，可以选择7.8 mm 内径的色谱柱。虽然许多HPLC系统也能够在这些内 径为4.6 mm的SEC色谱柱所需流速和背压下运行，但存在一个经常被忽视的事 实，即典型HPLC配置的柱外扩散相对大于这些UPLC SEC色谱柱所产生的峰体 积，导致观察到的峰分离度明显降低3。柱外扩散可以看作是样品在通过不含色 谱柱的LC系统流路时发生的体积增加现象。 沃特世解决方案 ACQUITY UPLC H-Class Bio系统 ACQUITY Arc Bio系统 ACQUITY UPLC BEH SEC蛋白分析专用柱, 200Å, 1.7 µm XBridge™ BEH SEC蛋白分析专用柱, 200Å, 3.5 µm 关键词 体积排阻、系统扩散、UPLC、UHPLC、HPLC、 蛋白质、IgG、英夫利昔单抗(Remicade®)