鳕鱼及其制品中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分检测BJS.PDFVIP

鳕鱼及其制品中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分检测 BJS 201907 1 范围 本方法规定了鳕鱼及其制品中裸盖鱼 （Anoplopoma fimbria ）、油鱼 （Lepidocybium flavobrunneum ，Ruvettus pretiosus ）和南极犬牙鱼（Dissostichus eleginoides ，Dissostichus mawsoni ） 源性成分的实时荧光PCR检测方法。 本方法适用于鳕鱼、鳕鱼片、鳕鱼扒等生鲜或速冻鳕鱼产品 （不包含鱼丸、鱼糕、鱼饼、鱼 肠、鱼豆腐、鱼肝油等加工产品）中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分的定性检测。 2 原理 使用商业化DNA提取试剂盒，获得适用于实时荧光PCR检测的DNA 。分别使用裸盖鱼、油鱼 或南极犬牙鱼特异性引物探针，通过实时荧光PCR反应，获得Ct值，根据Ct值判断样品是否检出 裸盖鱼、油鱼或南极犬牙鱼源性成分。 3 试剂和材料 除另有规定外，本方法中所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T 6682的一级水要求。所有试剂 均用无DNA酶污染的容器分装。 3.1 引物探针序列 3.1.1 裸盖鱼源性成分 NADH 基因 2 裸盖鱼源成分5 ’端引物：5 ’-AGGGACCACCCTAACATTCG-3 ’ 裸盖鱼源性成分3 ’端引物：5 ’-GTGGGTGGTGATGCTGTGCT-3 ’ 裸盖鱼源性成分探针：5 ’-FAM-CAGCTCTCACTGACTACTCGCATGA-BHQ 1-3 ’ 3.1.2 油鱼源性成分 Cytb 基因 油鱼源性成分5 ’端引物：5 ’-TAACTTCGGATGACTCATCCG-3 ’ 油鱼源性成分3 ’端引物：5 ’-AGTAAAGGCCTCGTCCAATGT-3 ’ 油鱼源性成分探针：5 ’-FAM-CATCCGAAACCTTCATGCAAACGGC-BHQ 1-3 ’ 3.1.3 南极犬牙鱼源性成分 CK 基因 南极犬牙鱼源性成分5 ’端引物：5 ’-CTGAATATGTAGGTGCATACG-3 ’ 南极犬牙鱼源性成分3 ’端引物：5 ’-TTGCTCTTTGTGTTTCGGTT-3 ’ 南极犬牙鱼源性成分探针：5 ’-FAM-TCCATTAGGTAAGCGAGCGGGAAGA-BHQ 1-3 ’ 3.1.4 内参照基因真核生物 18SrRNA —1—— 内参照5 ’端引物：5 ’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3 ’ 内参照3 ’端引物：5 ’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3 ’ 内参照探针：5 ’-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC-BHQ 1-3 ’ 3.2 商业化 DNA 提取试剂盒。 3.3 商业化 PCR 反应预混液。 4 仪器和设备 4.1 实时荧光 PCR 仪。 4.2 微量紫外分光光度计。 4.3 恒温水浴锅。 4.4 高速冷冻离心机：离心力 18,000 g 以上。 4.5 微量移液器（0.5 μL- 10 μL，10 μL- 100 μL，20 μL- 200 μL，100 μL- 1000 μL）。 4.6 涡旋振荡器。 4.7 天平：感量 0.001 g。 5 分析步骤 5.1 样品前处理 （1）样品只有单块鱼肉组成：使用灭菌剪刀适量剪取中心部位鱼肉。 （2 ）样品有五块以下鱼肉组成：使用灭菌剪刀适量剪取每个组成部分的中心部位鱼肉。 （3 ）样品有五块以上鱼肉组成：随机挑选5块鱼肉，使用灭菌剪刀适量剪取每个组成部分的 中心部位鱼肉。 将所取得的鱼肉使用灭菌去离子水洗涤，离心去除上清液，尽可能剪碎并混匀。 注：速冻鳕鱼产品应在完全解冻后再取样。 5.2 DNA 提取 按照商业化DNA提取试剂盒说明书中要求的取样量称取样品，每个样品设置两个平行，按照 商业化DNA提取试剂盒说明书操作。 5.3 DNA 浓度测定 取1 μL DNA 溶液，使用微量紫外分光光度计按照dsDNA（双链DNA ）计算方式检测其