课件：限制性酶切方式及连接.ppt

* * * 限制酶切方式及连接 1 限制酶切的方式 1.1 单酶切 1.2 双酶切 1.3 部分酶切 1.4 完全酶切 1限制酶切的方式 1.1 单酶切 若DNA样品是环状DNA分子，产生与识别序列（n）相同的DNA片段数。 若DNA样品是L—DNA片段，完全酶切产生n+1个DNA片段。 1限制酶切的方式 1.1 单酶切 酶切体系： 13μL ddH2O 反应体系 2μL 10×buffer 4μL 底物DNA 1μL 限制酶 总体积：20μL 酶切步骤： ⑴加样； ⑵摇匀，短时离心； ⑶反应1—3h； ⑷反应终止。 65℃水浴10—15min 1限制酶切的方式 1.2 双酶切 用不同的限制酶切割同一DNA分子的方法。 环状DNA分子完全酶切的结果，产生DNA片段数是两种限制酶识别序列数之和。 线性DNA分子完全酶切的结果，产生DNA片段数是两种限制酶识别序列数加1. 双酶切可以在不同的反应系统中进行。 A 需要较低盐浓度的酶先切割，然后升高盐浓度，另一个酶切割； B 最适反应温度较低的酶先切割，然后升高温度，另一个酶切割； C 第一个酶切割后，经凝胶电泳回收DNA，再选用合适反应系统，进行第二个酶的切割。 D 双酶切在同一个反应系统中。 1 限制酶切的方式 1.3 部分酶切 指限制酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的切割。 用途：当某种限制酶的多个识别序列之中有一个识别序列恰好在回收待用的DNA片段上，若完全酶切，将此DNA片段从中切断。 为了解决这个问题，就需要用到部分酶切，以满足实验的需要。 2 限制酶切后的连接 2.1 DNA ligase: 能催化dsDNA片段紧靠在一起的3‘羟基末端与5’磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接的一种核酸酶。 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA ligase 重组体 载体自连 目的基因 自连 2.2 DNA片段之间的连接 具互补黏性末端之间的连接 具平末端之间的连接 具互补黏性末端片段之间的连接 5‘GGACTG-0H P-AATTCTGCAA-3’ 3’CCTGACTTAA-P 0H-GACGTT-5’ E.coR I 切割 E.coR I切割 DNA ligase 5‘GGACTGAATTCTGCAA-3’ 3’CCTGACTTAAGACGTT-5’ E.coR I 识别序列 结论： 待连接的两个DNA片段的末端如果是用同一个酶切割的，连接后仍保留原限制酶的识别序列。 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA ligase GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA ligase 重组体 具平末端DNA片段之间的连接 5‘CAAGCTCA3’ 5’GTAGCTTA3’ 3’GTTCGAGT5’ 3’CATCGAAT5’ AluI AluI P-CTCA-3’ 5’CAAG-OH P-CTTA3’ 5’GTAG-OH OH-GAGT5’ 3’GTTC-P OH-GAAT-5’ 3’CATC-P T4 DNA ligase