PCR技术详细步骤..pdfVIP

PCR技术详细步骤－从RNA抽提到电泳鉴定 RNA抽提 一，准备工作 1， 实验器具与材料： （1） 移液枪：1ml、200ul、10ul （2） 吸头：1ml、200ul、20ul （3） 吸头台：放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个 （4） EP管1.5ml、100ul （5） 玻璃研磨器 （6） 容量瓶：1000ml （7） 盐水瓶：100ml （8） 15ml塑料管一个 （配75％乙醇用） 2， 实验器具的处理与准备 （1） 塑料制品： （包括吸头、EP管等） 将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中 （必要时小枪头需要用吸管打入 DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干 （或置 于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。 （2） 玻璃制品： （主要是玻璃研磨器） 先泡酸过夜，冲洗干净后，在1‰DEPC水中泡8小时左右，37℃烘干，用 蒙锡纸包裹送至干烤3次。 （3） 金属制品： （镊子等） 先洗干净，再送干烤3次。 （不需要泡DEPC水） 3， 试剂配制和准备： （1） DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加 1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。配75％乙醇的DEPC水 的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至 高压。 （2） 75％乙醇 （要在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制 （DEPC 水:无水乙醇＝1:3），然后放于-20℃备用。 （3） 异丙醇：放入棕色瓶 （4） 氯仿：放入棕色瓶 （5） Trizol：100ml/瓶 存放于4℃ 二，抽提时注意事项： 全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接 触可疑污染物。 三，抽提步骤 1． 匀浆化作用 取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨 组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗， 后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下，室温静置5分钟。 2． 分离阶段 每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，漩涡震荡15秒，使其充分 混匀，冰上静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。 3． RNA的沉淀 将上层水相转入新的1.5mlEP管中 （约400-500ul），加入0.5ml异丙 醇，混匀后放于-20℃中1小时，后12000rmp离心10分钟。 3 4． RNA的洗脱 小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml现配的75%的乙醇 （预冷）振荡洗涤 RNA沉淀一次，后7500rmp离心5分钟。 5． RNA的再溶解 小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干 （约30分钟，此时RNA 沉淀变透明）。注意不能让RNA沉淀完全干燥 （会极大地降低它地可溶 性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60℃下孵育10分钟助溶。 6，RNA的保存 提取的RNA保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录。 TRIzol法抽提总RNA 细胞1×107 组织100mg ↓ 加1mlTRIzol 细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块 ↓ 匀浆 （要彻底，后转至EP管） （组织匀浆量100mg时分装1ml/每EP管） ↓ 颠倒混匀10下，室温5分钟 ↓ 加氯仿1/5体积 （0.2ml） （必须按总体积的1/5） ↓ 颠倒混匀15S，室温5分钟 ↓ 4℃，离心12000rmp，15分钟 ↓ 转上层水相 （约400-500 μl）于另一新1.5mlEP管中 ↓ 加等体积异丙醇 （约400 -500 μl），混匀后-20℃中1小时 ↓ 4℃，离心12000rmp，10分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加冰预冷的75%乙醇 （用高压后的DEPC水配）1ml ↓ 4℃离心7500rmp，5分钟 ↓ 弃上清，超净工作台开风机干燥约30分钟 （不能完全干燥） ↓ 溶于DEPC水中至20 μl （10 μl-20 μl） （可在55-60℃水中，10分钟助溶） ↓ 立即保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录 4 逆转录 （RT） 一，准备工作 1， 实验器具与材料： （1）移液枪：200ul、10ul （2）吸头：200ul、20ul （3）EP管1.5ml、100ul （4）水浴箱 2，实验器具的处理与准备 塑料制品： （包括吸头、EP管等） 将塑料制品逐个浸泡于1