总RNA提纯试剂盒.DOC

总RNA提纯试剂盒 操作步骤 准备 估算Redzol或组织细胞的用量。每1ml Redzol的组织用量为50~100mg；细胞用量为5~10×106个细胞 组织或细胞的裂解 贴壁细胞 吸尽培养液，加入Redzol，用移液器反复吹打数次，确保全部裂解，然后转移至新的离心管中。裂解10cm2细胞需要1ml Redzol。 注：Redzol的加入量不是根据细胞数目来决定，而是根据细胞培养皿的面积（10cm2/ml）来决定。 悬浮细胞 离心收集细胞，吸尽液体，加入Redzol用移液器吹打数次，确保全部裂解（某些酵母和细菌要用匀浆器匀浆才能全部裂解），然后转移至新的离心管中。按1ml Redzol可裂解5~10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞的比例加入Redzol裂解细胞。 注：应避免在Redzol加入前洗涤细胞，这样会增加mRNA降解的几率。 组织 先将新鲜组织剪成小块，放入匀浆器内，加入Redzol用匀浆器匀浆，然后转移至新的离心管中。或者将组织在液氮中研磨成粉末后，加入Redzol中。每50~100mg的组织加入1ml Redzol进行裂解。 注：样品总体积不要超过所用Redzol体积的10%。 分相 a. 将匀浆液15~30℃ b. 每1ml Redzol中加入0.2ml的三氯甲烷（氯仿），震荡混匀后15~30℃静置2~ c. 12,000rpm离心15分钟。离心后混合物分成三相（下面的酚/氯仿相、中间的白色界面、上面的无色水相）。RNA全部在无色的水相中。 注：对于含有高浓度蛋白、脂肪、多糖或纤维素（肌肉、脂肪组织、植物的微管组织）的样品，在分相前可以附加一个分离步骤，匀浆后12,000rpm离心10分钟弃沉淀。RNA溶解在上清液中，纤维素、多糖、大分子量的DNA以不溶的形式沉淀从而与RNA分离。对于脂肪组织的样品，上面一层脂肪组织可以被清除掉，将清澈的匀浆液转移到另一新管中，继续进行第3步分相。 柱纯化 转移上层水相到另一新的1.5ml离心管中，加入200μl无水乙醇，颠倒混匀。 将混合液吸入离心纯化柱（硅胶膜）中，静置3分钟，12,000rpm离心2~3分钟。 倒掉收集管中的废液，将离心纯化柱重又套入收集管中。加入600μl RNA洗涤液，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。 12,000rpm再离心2分钟，尽量除尽液体。将离心纯化柱套入干净的1.5ml离心管中，加入50μl DEPC处理的超纯水或0.5% SDS于离心纯化柱正中（不要粘在管壁上），静置1~2分钟，12,000rpm离心1分钟。 将洗脱液吸入离心纯化柱中再洗脱一次，以提高RNA的回收量。洗脱下来的液体即是纯化的RNA，-20℃ 常见问题解答 每mg组织或106培养细胞的RNA产率 肝和脾 6~10μg 肾 3~4μg 骨骼肌和脑 1~1.5μg 胎盘 1~4μg 上皮细胞 5~8μg 纤维原细胞 5~7μg RNA产率低 样品裂解或匀浆不完全；提取的RNA溶解不完全。 A260/A2801.65 紫外检测时RNA样品应用水稀释，不能用TE稀释，低盐离子溶液和低pH值溶液致使其在280nm的吸收值增加（Wilfinger, W. et. al, Biotechniques 22: 474-481; Fox, D.K.(1998) Focus 20: 2 p.37）；样品匀浆时加入Redzol试剂体积太少，匀浆后溶液分层不明显，水相被酚污染；最后提取的RNA样品不能完全溶解。 RNA降解 使用的动物组织没有被立即冻上或放入Redzol中匀浆；分离使用的样品或制备的RNA长期贮存在-5~-20℃，而不是贮存在-60℃~ DNA污染 样品匀浆时加入试剂体积太少；分离使用的样品含有有机溶剂（乙醇，DMSO等），盐离子或碱溶液。