细胞生物学报告——动物细胞融合_图文_百度文库.DOCVIP

细胞生物学实验报告——PEG诱导动物细胞融合 山东大学细胞生物学实验报告 聚乙二醇（PEG）法诱导的动物细胞融合实验 2012/9/11 实验目的： 了解细胞融合技术的发展过程和主要方法的基本原理，用聚乙二醇(PEG)化学诱导法进行鸡血红细胞的融合实验，掌握实验的基本操作，观察鸡血红细胞融合的不同时期。 实验原理： 1. 细胞融合的概念 两个或两个以上的细胞或原生质体在自然或人为诱导的情况下细胞质膜相互融合，细胞质相互混合成为一个整体杂合细胞的现象被称为细胞融合。细胞融合可以发生在同种细胞之间也可以在不同物种间实现。 2. 细胞人工融合的主要方法及基本原理 细胞体外融合的主要方法分为病毒诱导，化学诱导和物 理诱导。1953年，M. Kuroya在临床中第一次分离到仙台 病毒（HVJ）[1]。1958年，日本学者Okada发现仙台病毒 （HVJ）能诱导动物细胞融合[2]，其基本原理是仙台病毒 的衣壳上有细胞表面受体的结合位点，可以诱导不同细 胞凝集，最终使不同细胞的细胞膜相互融合。 1974年，加拿大学者高国楠发明了细胞的聚乙二醇 （Polyethyleneglycol，PEG）化学融合法，由于该方法对 实验条件要求极低，试剂易得，操作简单，成为应用最广泛 的细胞融合方法。化学诱导细胞融合的基本原理是PEG等化 学物质能够诱导细胞膜磷脂分子的极性基团发生结构重 排，相互接触的细胞在细胞膜恢复过程中借助磷脂分子的亲图1. 仙台病毒示意图。a和b是病毒套和作用和表面张力实现融合。比之于仙台病毒诱导法，PEG膜，c为糖蛋白，d为类染色体。 诱导法的效率提高了几百倍。 80年代，科学家发明了细胞电融合法[4, 5] HYPERLINK /retype/zoom/01dc3f2a7375a417866f8ff7?pn=1x=0y=7raww=731rawh=242o=png_6_0_0_0_0_0_0_892.979_1262.879type=picaimh=158.90560875512995md5sum=064facb7204715b1cea3200e39ed03cfsign=832494c9d1zoom=png=0-195472jpg=0-0 \t _blank ，电融合法将细胞融合的产率提高到了50%-80%。电融合法的建立是基于细胞膜表面带电荷的性质。当在细胞悬液周围加入特定方向的电场时，细胞表面会发生极化现象，相邻的细胞将吸附在一起。这时突然提高电场强度，细胞间彼此接触的细胞膜会被击穿，细胞膜修复时受到磷脂分子间的亲和作用和细胞膜表面张力的作用将会发生融合。 图2. 以电融合方法得到的3T3-C2融合细胞 （引自J. Teissie等，1982 )。 细胞生物学实验报告——PEG诱导动物细胞融合 3. 细胞融合的应用 细胞融合最成功的应用是实现了大量制备单克隆抗体（Kohler Milstein，1975）。 图3. 以细胞融合技术制备单克隆抗体的流程示意图。 1975年，G. Kohler和C. Milstein首次成功使用细胞融合技术制备了抗绵羊血红细胞（SRBC）的抗体。他们首先用灭活的仙台病毒（HVJ）诱导小鼠对羊血红细胞免疫的脾细胞与小鼠多发性骨髓瘤细胞发生融合，然后以选择培养基（HAT）选择出杂交细胞，进而以SRBC作为免疫原筛选产生特异抗羊血红细胞的杂交细胞，最终获得了既能产生特异抗体又能无限增殖的杂交瘤细胞[3]。 此外，细胞融合技术在种质资源开发、膜蛋白研究等领域也有重要应用。 材料试剂： 新鲜鸡血，GKN 缓冲液，Alsever抗凝液，0.85% NaCL溶液，0.5ml 50%聚乙二醇（PEG，4000Da）溶液 仪器： 离心机，普通光学显微镜，玻璃刻度离心管，5ml注射器，胶头吸管，普通玻片 实验步骤： 1. 用注射器在公鸡翼下静脉处抽取新鲜鸡血2ml，加入8ml 抗凝剂Alsever溶液，混匀得细胞悬液。 2. 取1ml上述悬液加入4ml 0.85% NaCL溶液，以约1000r/ min 离心5min，弃上清后加入5ml 0.85% NaCL 溶液再次以约1000r/ min 离心5min。弃上清，加入5ml 0.85% NaCL溶液以约1000r/ min 离心7min，弃上清。 3. 向细胞沉淀中加入1-2ml GKN缓冲液，得到约10%的鸡血红细胞悬液。 4. 向上一步的悬液中加入约3ml GKN缓冲液使细胞悬液中鸡血红细胞的浓度达到1.5×107左右。 5. 取上一步悬液0.5-1.0 ml，贴壁加入0.5ml 50%聚乙二醇（PEG），静置约3min，混匀，加入1ml GKN缓 冲液混匀静置约2min后涂片观察。 6. 将肺癌细胞悬液与第4步处理后的鸡血红细胞悬液等体积混合，充分混匀后