遗传工程动物模型.ppt

显微注射法 胚胎干细胞法 (embryonic stem cells，ES细胞) 逆转录病毒感染法 精子载体法 细胞核移植 ENU诱变 显微注射法 胚胎干细胞法 (embryonic stem cells，ES细胞) 逆转录病毒感染法 精子载体法 细胞核移植 以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建好的载体DNA直接注射入受精卵的原核，再将接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育获得转基因动物个体。 目前应用较广泛，最早最经典的方法。 外源DNA大小基本不受限制（1～50kb）； 导入过程直观； 整合率高 设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求　 低效率（尤其是大家畜） 对卵子伤害大，胚胎存活率低 基因整合随机性 转基因沉默 基因特异表达的研究 发现基因的新功能 发现新基因 建立基因表达、调控的动物模型 建立人类疾病的动物模型等 胚胎干细胞(ES细胞) 能在体外培养，保留发育的全能性 外源目的基因 打靶载体 Neo（新霉素）阳性筛选标志 HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase) 打靶载体的构建 打靶载体导入ES细胞：重组置换 基因敲除ES细胞注射入胚泡 胚泡植入假孕小鼠的子宫中 嵌合体的杂交育种 Injection of ES cells into blastocysts 外源基因整合情况的可控性高。 可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性。 外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便。 ES细胞系建立及培养困难 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌合体 目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。 遗传病研究 肿瘤的研究 生物制药 转基因动物是在单细胞基因转染技术的基础上发展起来的。而许多基因的表达是无法通过转染的方法来研究； 基因表达有时空与组织的特异性； 外源基因的表达受特异性有关顺式作用序列的调控；因此，只有通过转基因的动物才有可能研究基因的表达、调控及基因之间的相互作用。 一、ENU诱变的技术路线 1. ENU诱变的简单流程 ENU处理雄性C57BL/6小鼠，10周后与同品系母鼠配种，Fl离乳时筛查，阳性突变小鼠留种，与同品系正常母鼠配种，Fl有亲代突变表型者留种(为显性遗传)，基因定位、培育新的模型、基因克隆、基因功能研究。隐性突变筛选需由Fl互交或F2回交Fl，发现突变表型者留种，进行进一步的研究。 2．显性突变的筛选 10周龄的雄性小鼠按150mg/kg体重的剂量腹腔注射ENU，60天后待处理公鼠恢复生殖能力后与野生型雌性配种，通过对F1代小鼠进行形态学、行为学、血液学、生理生化等指标的检测，可筛选基因的显性突变。 3．隐性突变的筛选 基因隐性突变的筛选需将F1代的雄性鼠与野生型雌性小鼠交配，再将F1代雌性小鼠与F1代雄性鼠回交或F2代雌、雄鼠交配，获得F3代小鼠，并将F3代小鼠用于大规模筛选。 4．基因驱动法与表型驱动法相结合的ENU诱变筛选 单基因剔除是典型的基因驱动的研究。研究者必须针对靶位点在染色体组文库中筛选相关的染色体组克隆，绘制相应的物理图谱，构建特异性的打靶载体以及筛选中靶ES细胞等。通常一个基因剔除纯合子小鼠的获得需要1年或更长的时间。面对人类基因组计划产生出来的巨大的功能未知的遗传信息，传统的基因剔除方法显得力不从心，不符合现代生物学高通量、大规模筛选的要求。 用放射线导致缺失和突变以及用各种化学诱变剂诱导点突变等许多经典的遗传学研究属于表型驱动的研究。 早在20世纪90年代初，研究者就提出带有第7号染色体缺失的小鼠可用来筛选ENU诱导的缺失区域内的点突变。基因打靶的研究进展使得研制携带染色体组任意片段的缺失、倒位或者易位突变小鼠成为可能。Ramirez Solis应用位点特异的重组酶系统首次在小鼠ES细胞中实现了最长3～4cM染色体组片段的缺失、倒位和重复。并采用同源重组技术构建了大片段染色体缺失的基因剔除小鼠。 将基因打靶这种基因驱动的研究和ENU诱变这种表型驱动的研究结合起来具有明显的优势。ENU诱变可以在短时间内产生大量的突变体小鼠，但点突变的鉴定依然是费时费力的工作。采用通过基因打靶获得的特定染色体组缺失或者易位的ES细胞建立突变小鼠可以简化筛选的程序和工作量，并把点突变限定在序列已知的区域内，这样可以大大简化点突变鉴定的过程。 5．ENU突变表型筛选 ENU诱导突变表型的筛选包括形态异常表型、行为和神经功能异常、血液学和临床