基于适配体的信号放大技术快速检测志贺氏菌-生物学·微生物学专业论文.docxVIP

分类号 分类号 密级 学校代码 10542 基于适配体的信号放大技术快速检测志贺氏菌 Rapid detection of Shigellaflexneri using signal amplification technique based on aptamer 指导老师姓名、职称 邓乐教授 学 科 专 业 生物学·微生物学 研 究 方 向 现代微生物技术 湖南师范大学学位评定委员会办公室 二零一五年五月 万方数据 摘要志贺氏菌属是造成世界范围流行痢疾和腹泻的罪魁祸首，全球每年大约有 摘要 志贺氏菌属是造成世界范围流行痢疾和腹泻的罪魁祸首，全球每年大约有 1．6亿感染痢疾，其中有超过1 10万人死于该疾病(主要是5岁以下儿童)。使用抗 生素治疗志贺氏菌病是公认的标准疗法，但是这种治疗手段的实际应用效果受限 于耐药菌株的广泛流行。鉴于治疗和预防志贺氏菌病都存在极大的困难，开发一 种简单、高灵敏性和特异性的检测方法已经迫在眉睫。而福氏志贺氏菌作为引起 发展中国家儿童中志贺氏菌病流行的主要病原菌被选为本实验目标。 作为一种单层的二维蜂巢状晶格结构的碳纳米材料，氧化石墨烯既具有出众 的生物相容性、极高的比表面积，又具有极高电子转移率。此外，它可以通过Ⅱ． Ⅱ堆积吸附单链DNA，而几乎不吸附刚性的双链DNA或aptamer-target复合物。 它还可以保护单链DNA不被酶降解。因此，氧化石墨烯在疾病诊断和生物分析 等应用中显示出其巨大的潜力。 通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)从人工合成的随机寡核苷酸文 库中体外筛选得到的能够高特异性高亲和力结合靶标的单链寡核苷酸(DNA或 者RNA)被命名为适配体。适配体能够高亲和力和强特异性的结合其相应的靶 标如蛋白质、有机物、各种细胞表面受体乃至整个细胞。相比于抗体而言，适配 体在耐受高温，价格低廉，可重复利用，易于合成和修饰等方面表现突出，因此 适用于生物传感器中的识别探针。同时，基于酶的信号放大技术可以轻易的放大 适配体．靶标之间的识别作用。因此，适配体可以用于食源性病原体的检测，尤 其适用于检测环境，食物和临床样本中的细菌。’ 本论文以实现福氏志贺氏菌的快速，高效检测这一热点问题为切入点，主要 开展了以下两个方面的研究工作： 万方数据 一、福氏志贺氏菌适配体的筛选和鉴定从DNA文库中筛选得到一组能够高亲和力和高特异性的结合福氏志贺氏菌 一、福氏志贺氏菌适配体的筛选和鉴定 从DNA文库中筛选得到一组能够高亲和力和高特异性的结合福氏志贺氏菌 的单链DNA适配体，然后对其进行分组，克隆和测序。挑选了其中三种单链 DNA并分别命名为aptarner 1，2，3。与其他两个候选适配体相比，aptamerl的 亲和力更高(解离常数为29-J：4 nM)，因此被选用进行后续实验。 二、构建适配体传感器快速检测福氏志贺氏菌 基于酶辅助的信号放大技术，氧化石墨烯和荧光基团修饰的适配体的使用， 构建了一个简单、高灵敏性和特异性的适配体传感器用以检测福氏志贺氏菌。此 传感器所使用的信号探针既包含了可以特异性识别靶标的福氏志贺氏菌适配体 序列，也包含了限制性内切酶ApaI的识别序列和末端修饰的两个FAM荧光基 团。无靶标的情况下，信号探针会自动吸附到氧化石墨烯表面，荧光信号被淬 灭。当加入靶标菌后，适配体会与靶标特异性结合，使荧光探针从氧化石墨烯表 面释放出来，ApaI立刻识别并水解与靶标结合的探针。此外，在后续过程中， 游离的靶标会吸引更多信号探针从氧化石墨烯表面脱离下来。在最适条件下，此 传感器的检测下限低至100 CFU／mL，并在500．108 CFU／mL之间呈现良好的线性 关系，同时具有很高特异性。因此，该适配体传感器可以替代传统的致病菌检测 方法。 关键词：福氏志贺氏菌，适配体，信号放大，氧化石墨烯，微生物检测 II 万方数据 ABSTRACTSh枷Ha ABSTRACT Sh枷Ha is a genus of bacteria that are a major cause of diarrhea and dysentery throughout the world，which causes roughly 1 20 millions of dysentery infections and kills over 1．1 millions of people(predominantly young children)worldwide every year．Antibiotics are the standard of care for shigellosis，but therapeutic options are limited by the widespread prevalen