第7章_第4节_分去子杂交和印迹技术(3_lmj).pptVIP

* * 1. 蛋白样品的制备(Protein sample preparation) 蛋白提取的质量直接决定着 WB 结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的！ 使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用商业化的试剂盒进行抽提。 一般实际用的比较多的是 RIPA裂解液，配方：50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS。 样品提取以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，然后取出部分蛋白定量，其余加入上样缓冲液 100℃充分变性，再分装保存于-20℃ 。 * 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大，大家可以根据具体情况选取。 Bradford法（考马斯亮蓝法） 考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在