聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳.PPTVIP

聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳 SDS实验目的 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS) 分离蛋白质的原理和基本操作技术。 实验原理 蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离 而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI) 时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动； 当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正 电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中 移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋 白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体(Acr)和交联 剂甲叉双丙烯酰胺(Bis) 在聚合剂过硫酸铵(APS)和 催化剂TEMED的作用下聚合交联成三维网状结构的 凝胶。 本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺 用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样， 当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶 时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由 于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通 过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的 速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移 动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压 缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛 效应。 浓缩胶的作用：浓缩效应 浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界， 而电泳液(pH8.3)中的甘氨酸分子则组成尾随边界， 在移动界面的两边界之间是电导较低而电位梯度较 陡的区域，它推动样品中的蛋白质前移，样品夹在 前导和尾随离子界面之间，使样品浓缩，并在分离 胶前沿积聚。 分离胶的作用：分子筛效应和电荷效应 在pH8.8分离胶中，甘氨酸离子化，迁移率超过 蛋白质，穿过堆积的多肽并紧随氯离子之后泳动。 SDS多肽复合物从电位梯度界面中解脱开来，在电 位和pH值均匀的区段泳动，依相对分子质量大小得 到分离。 实验步骤 1.将玻璃板安装于硅胶框中，封边。 2.按表1配制好分离胶后，将凝胶缓缓加入玻璃板 内，小心不要产生气泡。将胶液加到距短玻璃板上 沿2cm处为止。然后用细滴管或注射器仔细注入少 量水，约0.5-1mL。室温放置聚合30-40min。 3.待分离胶聚合后，小心倒去分离胶表面的水分， 按表2制备浓缩胶。用长滴管小心加到分离胶的上 面，插入样品模子(梳子)；待浓缩胶聚合后，小心 拔出样品模子。 4.将带胶玻璃板固定在电泳槽中，加入电泳缓冲 液，须没过上样孔。 5.将蛋白质样品与 上样缓冲液混合 后，100℃水浴 2min，加入上样 孔中，每孔10μL。 6.在80V电压下开始电泳，待样品前沿(溴酚蓝)进入 分离胶后，调整电压为130V继续电泳，当溴酚蓝 距离凝胶底部1-2cm时停止电泳。 7.小心剥离出凝胶，用0.25%的考马斯亮蓝R-250染 色10-20min，脱色至蛋白质带清晰，观察，拍照。 * 分离胶 (7-15%, pH8.8) 浓缩胶 (4-6%, pH6.8) 加样 加电场，样品浓缩在界面上 电泳结束 — + *