遗传学课件天第2章 基本技术.ppt

第二章　离体培养基本技术 1. 实验室组成 细胞工程实验室三个基本需要 实验准备:培养基配制，洗涤与灭菌等； 无菌操作； 控制培养。 如有条件还应该有辅助实验室 细胞工程实验室布局的基本要求是： 便于隔离 便于操作 便于灭菌 便于观察。 常用药品 药品等级：分析纯(Analytical reagent, AR). 化学纯CP. 在购置药品试剂时应多留意 一是名称问题，同物异名的情况较多 二是质量问题，假冒与劣质的情况较多 同一厂家的质量也不是很稳定，因此，最好能够试用后再确定。 仪器设备 1. 天平：0.1，0.001，0.0001ｇ ????2. 高压蒸汽灭菌锅：手提式，立式，卧式，全 自动式。 3. 超净工作台（0.3μm，24-30mpm） 4. 无菌室 5. 电冰箱 ?? 6. 烘箱（干燥箱） ?? 7. 酸度计（或pH试纸） 8. 微波炉（电磁炉或电炉） ? 9. 细菌过滤器 10. 真空泵 ? 11. 紫外灯 ?? 12. 红外灭菌器 ? 13. 显微镜、解剖镜 ?? 14. 蒸馏水器 ? 15. 空调机 16. 振荡培养器（摇床60-120次/min，冲 程10cm）、旋转培养器（转床，4rpm） ?? 17. 悬浮培养装置 ??? 18. 培养架（含照明灯管） 第二节 无菌技术 一、 要求无菌原因 离体培养必须在无菌条件下进行，为什么？ 原因： 植物免疫系统被破坏 植物细胞的分裂速度远低于微生物细胞 如果培养基有微生物，微生物的增殖速度会占据绝对优势，使培养系统污染并导致培养材料死亡 外植体和培养基都不能携带细菌或真菌 需要对外植体和培养基进行彻底灭菌，并 在无菌条件下进行操作。 二．无菌技术 无菌技术涉及：材料、培养基、器皿和接种工具的灭菌，操作环境和工作台面的灭菌。 处理方法： 物理灭菌法：指采用加热、辐射等物理手段达到灭菌目的的方法。 分为加热灭菌法、过滤除菌法、紫外线照射法、微波灭菌法、辐射灭菌和离心沉淀法。 化学灭菌法：是指用化学药品来杀灭微生物的方法。 包括：消毒剂消毒法和化学气体灭菌法。 物理灭菌法： 1、加热灭菌法：分为干热灭菌法和湿热灭菌法。 在同一温度下湿热灭菌的效果比干热好，主要是因湿热灭菌时有水分存在，蛋白质易变性，湿热的穿透力比干热大。 （1）干热灭菌法 ①火焰灭菌法：系指用火焰直接烧灼以达到灭菌的目的。 ②干热空气灭菌法：系指用烘箱等设备用高温干热的空气灭菌的方法。 （2）湿热灭菌法： 利用饱和水蒸汽或沸水等杀灭微生物方法，包括以下几种方法： ①热压灭菌法：本法系指在热压灭菌器内，利用高压饱和水蒸汽杀灭微生物的方法。 ②流通蒸汽灭菌法和煮沸灭菌法：系指在常压下用100℃的水蒸汽或用水煮沸以杀死微生物的方法。 ③低温长时灭菌法 (巴氏杀菌， 62.8℃/30min) 2、过滤除菌法 系指使药液通过除菌滤器中的适宜滤材，机械滤除，活的或死的细菌，得到不含细菌药液的方法。 3、紫外线灭菌法：紫外线可使微生物核酸蛋白变性死亡，同时空气受紫外线辐射后，产生微量臭氧，也起灭菌作用。 4、微波灭菌法：水可强烈吸收微波，使其极性分子转动，分子间的摩擦而生热，且升温迅速，靠热力灭菌。 5、辐射灭菌法：是应用α射线、β射线 等射线灭菌的方法。 化学灭菌法：包括消毒剂消毒法和化学气体灭菌法。 1、消毒剂灭菌法：消毒是指杀死病原微生物的方法，常用消毒剂有： 75%的乙醇等常用于表面灭菌。 0.1-1%升汞（HgCl2）； 1-5%次氯酸钠溶液； 2、化学气体灭菌法： 系指用化学药品的气体或产生的蒸汽进行杀灭微生物的方法。 （1）环氧乙 烷灭菌法； （2）高锰酸钾和甲醛混合熏蒸法（按照甲醛（40%）10毫升／立方米、高锰酸钾5克／立方米计算用量。不同情况下，用量有所不同，但比例约为2：1）。 ； （3）甲醛 丙二醇或过氧醋酸等化学药品蒸 汽熏蒸法 按照灭菌对象分 培养基：高压蒸汽灭菌或抽滤灭菌； 玻璃器皿：湿热(时间比培养基略长,之后进行干燥)和干热灭菌(在烘箱中加热至160-180度,后恒温保持40min)均可； 金属用具：使用前干热或湿热灭菌，使用中火焰灭菌或小型电热石英砂灭菌器灭菌； 操作环境：熏蒸（甲 醛+高锰酸钾)3-5h;紫外线照射0.5h;2%新洁尔 灭溶液. 外植体 :消毒剂灭菌 常用消毒剂