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流式细胞技术在血小板研究中的应用 血小板在各种诱导剂作用下释放其颗粒内容物，产生生物学效应，在初期止血过程中发生粘附?变形? 释放?聚集等反应，这些血小板的臬本反应，统称为血小板活化反应。血小板活化的检测对血小板相关疾病 的诊断有重要价值。然而，检测的方法常常是有争议的，通常是由于方法本身不完善或应用不当导致医源 性血小板激活，影响临床诊断的价值。这就要求建立一种灵敏、精确、快速、简便，最好可用于临床常规 检测血小板活化的方法。近儿年來，随満:流式细胞技术(Flow cytometry, FCM)的发展，FCM己广泛应 用丁?基础与临床研究，并逐渐成为检测血小板活化的重耍手段。现就FCM检测血小板活化的方法及临床 应用作一综述。 一、活化血小板标记物 活化血小板与静息血小板相比，其质膜糖蛋白常发生显著的变化，这些变化的糖蛋白便成为活化血 小板的检测标志物。主要包括三类： 1、第一类是血小板质膜表面糖蛋白 GPIIb/IIIa (CD41-CD61)它仅在血小板活化时才因构象变化而显露出来，因此，使用其荧光 单抗，就能更精确地在更早阶段检测到血小板的活化。 GPIb-IX-V (CD42)则相反，与静息血小板相比，活化血小板上表达量显著降低。可以作为 活化血小板的分子标志。 GPIV (CD36)虽然在静息血小板上也表达，但活化血小板上表达量更高，也可以作为血小 板活化标志。 另外还有 GP I c/lla (CD49e-CD29)、GP I a/Ila (CD49b-CD29)等与血小板活化有关。 2、第二类是血小板颗粒膜糖蛋白 主要包括血小板a?颗粒膜蛋口 (GMP-140, CD62)和溶酶体完整膜蛋口(LIMP, CD63)。血小板 被激活时，其颗粒膜与质膜发生融合，在质膜上表达，成为活化血小板的分子标志。 3、第三类是出现在活化血小板上能与血小板表面受体相结合的一些抗原 包括纤维蛋白原，Xa因子等，这些抗原在血小板表而的出现和消失在临床检测上也是有意义的。 膜糖蛋白CD单抗功能 GPIIb/llla CD41/CD61* 聚集 GPIb/IX CD42b-CD42a 粘附 GPIa/IIa CD49b-CD29 粘附 GPIc/IIa CD49e-CD29 粘附 GPIV CD36 粘附 GPV CD42d凝血酶底物 GMP-140 CD62p血小板与炎性细胞相互作用 GP53 CD62 * CD41即是GPIIb/llla的单抗又是GPIIb的单抗,CD61是GP Illa的单抗 二、流式细胞术检测血小板活化 1、常规方法 山于血小板的活化程度可山血小板膜相关糖蛋口表达水平的高低来判断，FCM测定相关糖蛋口的表 达情况就成为检查血小板功能的-?种新手段。血小板活化时其质膜糖蛋白较其静止期发生显著改变，FCM 可以通过单抗免疫荧光标记（如抗GPIIb/IIIa、抗GPIIb、抗GPIIIa、CD62P、CD63等）测定平均荧光 强度或特异性荧光抗体结合阳性血小板的百分率來检测血小板的活化情况。检验过程：样木制备（全血法、 洗涤血小板法、富含血小板血浆法）一＞荧光染色（FITC、PE、PerCP）-＞流式检测数据分析。 传统的流式细胞术检测血小板膜糖蛋白的表达，常用的样本是经洗涤的血小板或富含血小板的血浆。 由于血小板极易活化激惹，样本经离心、洗涤等步骤，容易人为地导致体外血小板激活，影响临床诊断价 值。为此，Shatti等引入了全血法流式细胞术。该技术能尽可能的避免血小板体外页源性激活，防止血小 板业群丢失；在最接近受检者体内环境的条件下测定血小板活化状态。同时不会受其它种类细胞或碎片的 干扰，保证了检测的特异性。但是如果采血后不能立即检测（3小吋内），则需用固定法，可以在5天内 检测，但固定法的步骤较为繁琐，耗费时间，且容易人为活化，所以很多实验室还是倾向于全血法。 血小板结合位点绝对数的测定一直是个难题，而用普通的FCM只能得出一个相对值。Shatti等发现 碘标测定的血小板结合位点数与荧光强度间有线性关系。因此，可以通过这一线性关系，在流式细胞仪定 最分析后换算该抗体结合位点的绝对数H。 2、三色流式分析方法检测血小板活化 三色流式分析法是在常规FCM检测基础上发展起來的一种多参数分析，可以更全而、更系统的获得 血小板相关信息。 血小板活化试剂组 （1）PAC-1-FITC抗体：IgM型，与活化的GPIlb/llla复合物结合，是早期血小板活化标志物。R GDS为PAC-1FITC抗体结合附断剂，作阴性对照。 （2） CD62P-PE抗体：lgG1型。血小板活化吋表面的CD62P结合，是血小板活化后期的标志物。 3） CD61-PerCP： lgG1型。特异的泛血小板表面标记，既与活化血小板结合，也与未活化血小