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第二章 基因工程制药 主讲人：吴晓敏 第三讲 基因工程制药 第一节 概述 第二节 基因药物生产的基本过程 第三节 目的基因的获得 第四节 基因表达 第五节 基因工程菌的稳定性 第六节 基因工程菌生长代谢的特点 第七节 基因工程菌发酵 第八节 基因工程药物的分离纯化 第九节 基因工程药物的质量控制 第十节 基因工程药物制造实例 第一节 概述 基因工程即重组DNA技术，是指对不同生物的遗传基因，根据人们的意愿，进行基因的切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型。世界上第一批重组DNA分子诞生于1972年，次年几种不同来源的DNA分子装入载体后被转入到大肠杆菌中表达，标志着基因工程正式登上历史舞台。基因工程彻底改变了传统生物科技的被动状态，使得人们可以克服物种间的遗传障碍，定向培养或创造出自然界所没有的新的生命形态，以满足人类社会的需要。 传统生物药物由于来源及制备上的困难、价格等因素的影响，此外在制备过程可能受到的感染等问题，促使人们寻求安全、实用、疗效可靠的新方法来制备生物药物。基因工程正在逐渐显示其在生物技术药物制备上的优势。 应用基因工程技术可十分方便且有效地解决上述提到的问题，从量、质上都可以得到改进，且可以创造全新物质。 利用基因工程技术生产药品的优点： （1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障； （2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围； （3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质； 利用基因工程技术生产药品的优点： （4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除。 （5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 基因工程技术可将不同种类和用途的基因，在原核细胞中表达的特性使其不仅在医药，而且在很多行业中都会有重要的应用。 第二节 基因工程药物生产的基本过程 基因工程技术就是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。 基因工程药物制造的主要程序是：目的基因的克隆，构建DNA重组体，将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌，工程菌的发酵，外源基因表达产物的分离纯化，产品的检验等。以上程序中的每个阶段都包含若干细致的步骤，这些程序和步骤将会随研究和生产条件的不同而改变。 基因工程药物制备的一般过程 基因工程药物生产的上游和下游 上游：主要指的是目的基因分离、工程菌（或细胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成； 下游：主要指的是从工程菌（或细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等。 工程菌（或细胞）构建中重要的工具 该过程中重要的工具便是酶：限制性内切酶和连接酶。 目的基因进行限制性内切酶和核苷酸序列分析。 基因表达系统 有原核生物和真核生物两类表达系统；选择基因表达的系统主要考虑的是保证表达蛋白质的功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。 下游阶段在产业化中是极其重要 下游阶段主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。 工程菌的发酵工艺需要对影响目的基因表达的因素进行分析，对各种影响因素进行优化，建立适于目的基因高效表达的发酵工艺，同时建立一系列相应的分离纯化、质量控制、产品保存等技术。 第三节 目的基因的获得 目的基因：所谓目的基因就是我们想要的基因片段，它在生物体内能表达产生所要蛋白产物。 生物界的基因有上亿个，多数存在于染色体上，少数存在于细胞质中。取得目的基因的办法是用“分子剪刀”剪切供体DNA分子，把它切成一些比基因略长的片段，然后再从中找出包含所需目的基因的DNA片段。到目前为止，人们用这种方法已分离出40种大肠杆菌蛋白质基因、鸡的组蛋白基因等。另一种获得目的基因的方法是人工合成，即基因模版合成。 基因模板合成法：就是先以信使RNA为模板，反向转录出一条DNA单链，再以互补的方式加倍成DNA双链。用这种方法人们已先后合成了家兔、鸭和人的珠蛋白基因、羽毛角蛋白基因等。 目前克隆真核基因常用的方法有 逆转录法和化学合成法 一、逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。为了克隆编码某种特异蛋白质多肽的DNA序列，可从产生该蛋白质的