生物制药-第四章(1).ppt

2010年6月生物制药 温州医学院 生命科学学院 王慧利 内容 第一章绪论 第二章 生物药物概论 第三章 生物制药工艺学 第四章 基因工程制药 第五章?抗体工程制药 第六章 动物细胞制药 第七章 植物细胞制药 第八章 酶工程制药 第九章 海洋生物制药 第十章 利用现代生物技术改造传统制药工业 第四章 基因工程制药 第一节 基因工程概念，历史和基本原理 第二节 基因工程用到的酶，载体 第三节 基因工程技术环节和常用技术 1目的基因获得 2目的基因与载体连接 3 外源DNA导入细胞 4 重组子的鉴定和筛选 5 常用技术 第四节 基因工程在制药中的应用 1 重组药物 2 转基因动（植）物 （一）基因工程（gene engineering）的概念 又称为遗传工程、重组DNA技术，是按着人们的科研或生产需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质（DNA片段），在体外切割，拼接形成重组DNA,然后将重组DNA与载体重新组合，再将其引入到没有该DNA的受体细胞中，进行复制和表达，生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。 按目的基因的克隆和表达系统，分为原核生物基因工程， 酵母基因工程，植物基因工程和动物基因工程。基因工程具有广泛的应用价值，为工农业生产和医药卫生事业开辟了新的应用途径，也为遗传病的诊断和治疗提供了有效方法。基因工程还可应用于基因的结构，功能与作用机制的研究，有助于生命起源和生物进化等重大问题的探讨。 ??? 基因工程有两个重要的特征 第一是可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中，因此可以实现按照人们的愿望，改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状； 第二是某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为准备大量纯化的DNA片段提供了可能，拓宽了分子生物学的研究领域。 1 基因工程诞生的理论基础（理论上的三大发现） （1）40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题； （2）50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和传递的问题； （3）50年代末期和60年初，相继提出了中心法则和操纵子学说，并成功的破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。   4 DNA测序技术的建立进一步促进了基因工程的发展 （三）基因工程基本原理和流程 第二节??基因工程中常用的工具酶和载体 一、限制性内切酶 ○ 基因工程中常用作用于核酸的酶，包括水解酶、修饰酶、聚合酶等 水解酶分为内切酶和外切酶 ○ 内切酶在核酸链内部切割，生成寡核苷酸；外切酶从核酸链的末端开始，渐进式地水解核酸链，逐渐释放单核苷酸。 限制性内切核酸酶(restriction enzymes) 能识别双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列，在这一段序列内将双链DNA分子切断。 功能：与甲基化酶一起降解外来DNA分子，以限制(restriction )或阻止病毒侵染， 是细菌细胞为防御异源遗传物质进入的一种有效方式。 限制性内切酶分类 第Ⅰ类限制性酶：每隔一段DNA序列随机切割双链DNA分子，没有序列特异性 第Ⅱ类限制性酶：能识别一段特异的DNA序列，准确地酶切双链DNA的特异序列 A：形成粘性末端产物：识别的序列是对称的，即在一条链中从5’到3’方向的序列，与其互补链从5’到3’方向的序列完全相同。这种从两个方向阅读而序列相同的序列称为回纹对称序列(palindrome)（EcoRⅠ） B：形成平端产物：另一类酶，如SmaⅠ，它们酶切DNA双链后，产生的DNA片段具有平齐末端(blunt ends) 限制性酶EcoRI识别位点（粘性末端） EcoRI酶切不同来源的DNA及退火重组 平齐末端（SmaⅠ） 限制性内切酶的命名 DNA聚合酶的特性 该酶的用途是将带匹配黏端的双链DNA或平端双链DNA片段的5’- P 与另一也带相应缺口的DNA片段的3′ - OH 连接起来 不匹配黏端的连接 先补平或修平后再连接 （二）???基因工程载体 ● 载体是指将外源DNA片段运送进宿主细胞进行扩增或表达的运载工具 ● 克隆载体——克隆了外源DNA后，转入宿主细胞中进行繁殖，使克隆的DNA片段数量大大增加 ● 表达载体——将外源基因或DNA片段在宿主细胞中表达蛋白质 ○ 插入型载体