高效毛细管电泳跟其在体内药物分析中的运用.doc

高效毛细管电泳及其在体内药物分析中的应用 摘要 本文主要综述了高效毛细管电泳技术近年来研究进展及其在体内药物分析中的应用。 关键词 高效毛细管电泳 体内药物分析 样品浓缩技术 高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis，HPCE)又称毛细管电泳，指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间迁移率和或分配行为上的差异而实现分离的一种液相分离技术。此技术可分析的成分小至有机离子，大至生物大分子如蛋白质、核酸等。可用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等，HPCE分析高效、快速、微量，与HPLC有并驾齐驱的趋势。 1 HPCE的几种经典分离模式 HPCE可分析的成分小至无机离子，大至生物大分子，如蛋白质、核酸等。可用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等，HPCE分析高效、快速、微量。根据其分离样本的原理设计不同主要分为以下几种类型：毛细管区带电泳(CZE)；毛细管等速电泳(CITP)；毛细管胶束电动色谱(MECC)；毛细管凝胶电泳(CGE)；毛细管等电聚焦(CIEF)。目前CZE和MECC用得较多，本文以这两种方法为例来说明HPCE的原理。1.1 CZE的基本原理 HPCE选用的毛细管以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间浓度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫作电泳。HPCE所用的大理石英毛细管柱，在pH3情况下，其内表面带负电，和溶液接触时形成了一双电层。在高电压作用下，双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象叫电渗，粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流(E0F)两种速度的矢量和。正离子的运动方向和电渗流一致，故最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，故其迁移速度相当于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳流速度，故在中性粒子之后流出，从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。 1.2 MECC的基本原理 MECC?是把一些离子型表面活性剂(如十二烷基硫酸钠，SDS)加到缓冲液中，当其浓度超过临界浓度后就形成有疏水内核、外部带负电的胶束。虽然胶束带负电，但一般情况下电渗流的速度仍大于胶束的迁移速度，故胶束将以较低速度向阴极移动。溶质在水相和胶束相(准固定相)之间产生分配，中性粒子因其本身疏水性不同，在二相中分配就有差异，疏水性强的和胶束结合牢，流出时间就长，最终按中性粒子疏水性不同得以分离。MECC使HPCE能用于中性物质的分离，拓宽了HPCE的应用范围，是对HPCE极大的贡献。 2. 高效毛细管电泳应用中存在的缺陷及改进方法 2.1定量精密度较差。在用毛细管电泳做定量检查时，所得数据的RSD值通常较大，常采用内标法,以提高其定量精密度。如Davydova[1]等以氨基苯甲酸为内标法测定小鼠尿液、血浆中的碘他拉酸盐,结果测定低浓度碘他拉酸盐时,5份样品的准确度为98.0%,RSD为6.4%,测定高浓度时,准确度为99.7%,RSD为0.8%。 2.2 灵敏度较低。在用毛细管电泳法对样品痕量物质的检查时，一方面组分浓度较小，另一方面检测器，进样方法的差限，导致灵敏度较低。随HPCE的不断完善,提高灵敏度的措施也愈来愈多。目前，提高毛细管电泳检测灵敏度的措施主要有3种[2]：样品的预处理．采用更高灵敏度的检测器，采用样品浓缩技术。 2.2.1样品的前处理 样品的前处理是提高灵敏度的重要措施，在体内药物分析中,常见的样品有血浆、血清、尿液和头发等,为避免样品中的蛋白质和盐等基质对分析测定的干扰,常需对样品进行预处理。HPCE?对样品的预处理要求,没有HPLC和GC那么严格。常用的预处理方法有沉淀法和萃取法。 沉淀法中，当待测物浓度足够大时,可离心进样或经简单离心过滤后进样。若样品中含盐和蛋白质,可用在柱微渗析或小孔聚丙烯酰胺凝胶将待测物与上述基质分离。待测物分子较小且与高浓度蛋白质混合时,可用超滤法或排阻色谱法分离。 萃取法主要有液-液萃取(LLE)和固相萃取(SPE),这2种萃取方法都是基于待测物质在两相之间分配行为的差异,都适用于基质干扰较大,待测组分数量较多,尤其是含脂溶性成分较多的样品。 也有将液-液萃取与固相萃取相结合,在消除样本中杂质的同时,可以提高检测灵敏度,如测定血清中R-和S-司可巴比妥[3]的含量就采用此法。其最低检测限(LOD)达到1μg/mL。 2.2.2 样品浓缩技术的采用 样品浓缩技术是采用特殊的进样过程将大体积样品溶液中的痕量被测物浓缩后进行分离，从而提高检测灵敏度的一种技术 ,毛细管电泳中的样品浓缩技术有柱上浓缩与柱前浓缩之分。