抑制消减杂交法分离与鉴定灵芝G蛋白β亚基基因.pdfVIP

实 验 技 术 diblefungi 2012 （2 ） 抑制消减杂交法分离与鉴定灵芝 G 蛋白β亚基基因 1，2 2 1*，2 徐军伟 赵 蔚 钟建江 （1华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海闵行200237；2上海交通大学微生物代谢国家重点实验室，上海闵行200240） 摘 要 灵芝细胞在液体静置和振荡培养方式下，抗癌物质灵芝 1.2 灵芝菌丝RNA的提取 按照Invitrogen公司TRizol试剂 酸的产量有显著的差别。采用抑制消减杂交法分离了灵芝细胞在 说明书提取总RNA，Promega公司的PolyATtractmRNAIsolation 两种不同培养方式下差异表达的基因，对构建的差减文库进行筛 Kit从总RNA中分离mRNA，用于灵芝抑制差减文库的构建。 选后获得了一个灵芝的EST序列。根据这个EST序列，采用 1.3 抑制差异文库的构建与差异基因的筛选 以液体静置 RACE-PCR的方法成功克隆到了灵芝G蛋白β亚基（Gb）基因 培养第2天的灵芝mRNA作为检测组（此时开始形成气生菌 （GenBank登录号GQ293361）。序列分析显示这个基因cDNA全 丝和无性孢子），振荡培养第2天的灵芝mRNA作为对照组， 长1217 bp，编码了313个氨基酸。同源性分析表明其编码的氨 构建差异表达文库。文库的构建依据Clontech公司的The 基酸与其他蘑菇类真菌Gβ的氨基酸序列同源性较高，与Copri⁃ PCR-SelectcDNASubtractionKit进行操作，探针的标记和文 nopsiscinerea （XP_001830441.1）、Lentinulaedodes （AAP13580.2） 和Schizophyllumcommune （XP_003029882.1）的一致性分别达 库的筛选根据Roche公司DIGHighPrimeDNALabelingand 到91%、91%和90%。实时荧光定量PCR结果表明这个基因在液 DetectionStarterKitII进行操作。进行点杂交筛选后，挑选差 体静置培养方式下的表达量显著高于振荡培养。 异表达的克隆进行测序。 关键词 灵芝 G蛋白β亚基 差异表达 1.4 灵芝GβcDNA的克隆 根据从文库中筛选获得的一 文章编号 1000-8357（2012）02-0062-03 个克隆3G8的序列，利用cDNA末端快速扩增（RACE）法分 灵芝是一种珍贵的高等药用真菌和名贵中草药，用它来 别获得它的两端序列，最终拼接后获得灵芝Gb基因的全长 预防和治疗疾病已有几千年的历史。灵芝酸是灵芝的重要 cDNA序列。RACE试验采用Takara公司的5′-and 3′-Full [1] RACEKit进行。扩增用到的引物分别为：5′-RACEouter： 药用成分之一，具有抗癌、抗艾滋病、免疫调节等活性 。目 前生产灵芝酸的两种主要方式是灵芝细胞液体静置培养和 GCATTATGAGACGACAGTCCACA；5′-RACE inner：GTT⁃ [1]，[2] GGGGCTCTGGGCGAAGTC；3′-RACE outer：CCTGACTTC⁃ 振荡培养 。笔者前期的研究表明与传统的振荡培养相