木本曼陀罗中一条新的TRI基因克隆与酶活功能鉴定Cloning-药学学报.PDFVIP

·574 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2019, 54(3): 574 −581 木本曼陀罗中一条新的TRI 基因克隆与酶活功能鉴定 1 2 3 1 1 1* 强 玮 , 夏 科 , 赵许朋 , 付 维 , 满建民 , 张明生 (1. 贵州大学生命科学学院/ 山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室, 贵州贵阳550025; 2. 中国科学院广西植物研究所, 广西桂林541006; 3. 贵阳学院, 贵州贵阳550005) 摘要: 托品酮还原酶I (tropinone reductase I, TRI) 是托品烷生物碱 (tropane alkaloids, TAs) 合成途径中游分 支点处的关键酶, 可引导托品酮代谢流进入TAs 合成, 因此是TAs 代谢工程重要的靶标基因。本研究从木本曼陀罗 (Datura arborea) 中克隆到了一条新的TRI 基因, 命名为DaTRI2 (GenBank 登录号为MH705164) 。DaTRI2 基因 cDNA 全长1 135 bp, 与DaTRI 序列一致性为96.8%, 预测编码272 个氨基酸。DaTRI2 蛋白具备茄科TRI 保守的结合 NADPH 的TGXXXGXG 基序、结合底物托品酮的11个保守氨基酸残基以及发挥催化活性的N-S-Y-K 四联体基序。 进化关系上, DaTRI2 和茄科的TRI 成员聚为一支, 与Datura 属的TRI 亲缘关系最近。对DaTRI2 进行原核表达, 纯 化的重组蛋白能催化托品酮还原反应和托品氧化反应, 最适pH 值分别为8.0 和9.6 。DaTRI2 在pH=6.4 时, 对托品酮 的K 和V 分别为210.05 μmol ·L-1 和69.6 nkat ·mg-1 protein, 在pH=9.6 时, 对托品的K 和V 分别为188.03 μmol ·L-1 m max m max 和114 nkat ·mg-1 protein 。qPCR 检测表明DaTRI2 在幼叶中表达量最高, 其次是须根。DaTRI2 基因的克隆和酶活力 分析为深入研究木本植物中TAs 的生物合成分子机制奠定了基础, 同时为TAs 代谢工程提供了一个更高效的候选 靶基因。 关键词: 托品酮还原酶; 木本曼陀罗; 托品烷生物碱; 酶反应动力学 中图分类号: R931 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870(2019)03-0574-08 Cloning and enzymatic function characterization of a novel tropinone reductase I (DaTRI 2) in Datura arborea 1 2 3 1 1 1* QIANG Wei , XIA Ke , ZHAO Xu-peng , FU Wei , MAN Jian-min , ZHANG Ming-sheng (1. School of Life Sciences / Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region Ministry of Education,