海绵共附生微生物种群结构的DGGE指纹分析-生物化工专业论文.docxVIP

附件四 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人在导师的指导下 独 立进行研究工作所取得的成果 除文中已经注明引用的内容外 本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果 对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体 均已在文中以明确方式标明 本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担 学位论文作者签名 何丽明 日期 2005 年 1 月 14 日 附件五 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查阅和借阅 本人授权上海交通大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文 保密在 年解密后适用本授权书 本学位论文属于 不保密 请在以上方框内打 学位论文作者签名 何丽明 指导教师签名 李志勇 日期 2005 年 1 月 14 日 日期 2005 年 1 月 14 日 上海交通大学硕士学位毕业论文 上海交通大学硕士学位毕业论文 第 第 PAGE 10 页 共 84 海绵共附生微生物种群结构的 DGGE 指纹分析 摘 要 本文采用 PCR-DGGE 基因指纹技术对我国南海四种海绵 细薄星芒 海绵 皱皮软海绵 贪婪掘海绵和澳大利亚厚皮海绵的共附生微生物 的种群结构组成以及其中可培养的部分微生物的组成进行研究 目的 在于为今后开发利用海绵微生物生产活性物质奠定基础 由于海绵特殊的骨骼及骨针等保护结构 使得海绵微生物总 DNA 的提取非常困难 但这又是开展海绵共附生微生物分子生态学研究的 基础 通过对比直接研磨法 加金钢砂研磨法 玻璃匀浆-超声波破碎 法及冻融法四种方法来提取海绵共附生微生物总 DNA 的效果 建立了 一种高效快捷的海绵共附生微生物总 DNA 的提取方法 研究发现直接 研磨法提取到的海绵微生物总 DNA 效果最好 能够有效并快捷的提取 到高质量的海绵共附生微生物总 DNA 该方法提取到的海绵微生物总 DNA 不仅量多 而且很纯 适合作为于 16S rDNA PCR 扩增等分子生物 学实验的 DNA 模板 这对于我们采用变性梯度凝胶电泳技术DGGE 来研究海绵共附生微生物组成非常重要 也为今后采用现代分子生物 学方法对海绵微生物进行深入研究奠定了基础 对提取到的四种海绵共附生微生物总 DNA 的 16S rDNA-V3 进行 PCR-DGGE 基因指纹图分析是我们整个海绵共附生微生物研究的重点 PCR-DGGE 基因指纹图显示海绵共附生微生物的组成多样性是非常丰富 的 通过聚类分析发现海绵具有微生物组成的宿主特异性 总体上细 薄星芒海绵与皱皮软海绵微生物组成相似 贪婪倔海绵和澳大利亚厚 皮海绵的微生物组成相似 为进一步了解海绵微生物组成的详细信息 我们对四种海绵的 DGGE 图谱上优势性菌群条带进行了割胶回收 分子 克隆并测序 最后对测序结果做了系统发育树分析 系统发育分析表 明 澳大利亚厚皮海绵中的 Bacillales Actinobacteria 是其所特有 的 而 Gammaproteobacteria 为四种海绵所共有 系统发育分析还显 示四种海绵共附生细菌主要以变形菌门proteobacteria为主 在 我们克隆出的 42 条海绵共附生优势性细菌的条带中 与变形菌门最相 似的占 78.6% 其它的主要是一些 Bacteroidetes 门 占 14.3% 厚壁 菌门Firmicutes占 4.8% 与 GenBank 比对结果显示 与贪婪倔 海绵海绵中的 C2 C7 及细薄星芒海绵中的 A2-3 最相近的菌相似度分 别只有 93% 95%和 95% 推测很可能是新菌 澳大利亚厚皮海绵中的 D10 是我们实验中发现的唯一与放线菌序列最相似的条带 通过对四 种海绵共附生微生物的原位 PCR-DGGE 研究 克服了传统培养技术的不 足 使我们对海绵共附生微生物的优势种群组成及特点有了比较全面 的认识 最后我们采用 PCR-DGGE 基因指纹技术比较了海绵原位微生物组 成及培养微生物种群组成的变化 并对培养富集的条带进行了克隆测 序和系统发育树分析 不同培养基对海绵微生物的培养具有选择作用 不同的培养基富集培养的微生物不同