海参体壁中胶原蛋白酶的分析-食品科学专业论文.docxVIP

海参体壁中胶原蛋白酶的研究 摘 要 海参（Sea cucumber, holothurians）以其高营养价值并极具药用价值而成为重要的海洋 经济动物。当海参受到一定的外界刺激时很容易发生自溶现象，给其保鲜、贮藏、运输和 加工等环节带来诸多问题，并造成资源浪费和经济损失。体壁作为海参的主要可食部分， 主要由胶原蛋白和酸性粘多糖组成。海参的自溶与其体内蛋白酶的作用密切相关。但是， 目前对于海参自溶过程中能够引起胶原蛋白降解的蛋白酶的种类和性质了解甚少。本文以 刺参（Stichopus japonicus）为研究对象，研究其体壁中胶原蛋白酶的存在情况，进一步实 现胶原蛋白酶的高度纯化并对其性质进行深入分析，为阐明海参胶原蛋白的代谢机制和海 参自溶机理等提供实验依据和理论参考。 通过测定不同蛋白酶抑制剂对海参体壁粗酶液降解其胶原蛋白能力的抑制作用，发现 金属蛋白酶抑制剂 EDTA，EGTA 和 1,10-phenanthroline 能够强烈抑制海参体壁粗酶液对胶 原蛋白的降解，丝氨酸蛋白酶抑制剂 PMSF 和 Benzamidine 对胶原蛋白的降解有轻微的抑 制作用，其它蛋白酶抑制剂无明显影响。因此，推测在海参体壁中存在着能够分解胶原蛋 白的金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。 通过硫酸铵盐析、DEAE-Sephacel 离子交换层析、Sephacryl S-200 凝胶过滤层析、 Q-Sepharose 离子交换层析和 Phenyl-Sepharose 疏水层析等方法，首次从海参体壁中纯化得 到一种金属蛋白酶（Metalloproteinase, MP）。SDS和明胶酶谱结果显示 MP 的分子 量约为 45 kDa，酶在弱碱性 pH 范围内（8.0~9.0）表现出较高活性，最适温度在 40~45 °C 之间。金属蛋白酶抑制剂可明显抑制其活性，其他蛋白酶抑制剂对 MP 活性则没有明显影 响。质谱分析得到 3 个肽段共 58 个氨基酸残基，与假单胞菌碱性金属蛋白酶同源性较高 （91.4 %），证明纯化的目的蛋白是一种金属蛋白酶。Ca2+能够显著影响 MP 活性，表明 它是一种 Ca2+依赖性金属蛋白酶。MP 不仅在 37°C，甚至在 4°C 都可以有效降解海参胶原 蛋白，推测其很可能是参与海参自溶过程中降解胶原蛋白的一种重要蛋白酶。 通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sephacel 离子交换层析、Sephacryl S-200 凝胶过滤层析、 Q-Sepharose 离子交换层析，从海参体壁中纯化到一种丝氨酸蛋白酶（Serine proteinase, SP）。 SP 的分子量约为 30 kDa，SP 的最适温度和最适 pH 分别为 45 °C 和 9.0。丝氨酸蛋白酶抑 制剂 Chymostatin, Pefabloc SC 等可明显 SP 活性，半胱氨酸蛋白酶抑制剂 E-64 也有一定的 抑制作用，而 其 他 类 型 抑 制 剂 对 其 活 性 没 有 明 显 影 响 。 该 酶 分解 荧 光 底 物 Boc-Leu-Lys-Arg-MCA 的活性最高，米氏常数 Km 和 kcat 值分别为 5.507 μmol/L 和 0.6 s-1。 SP 对海参胶原蛋白同样具有较明显的分解作用，因此推测其可能也参与海参自溶过程中对 胶原蛋白的降解。 I II II 蛋白酶种类繁多，参与机体新陈代谢，在生物体生命活动中发挥着重要作用。本文以 刺参为研究对象，首次建立了二种不同类型蛋白酶（MP 和 SP）的纯化方法，并对它们的 酶学性质进行了详细的研究，本文研究结果为解析海参自溶机理提供了理论依据，对海参 保鲜、加工，特别是海参保鲜剂的开发有潜在的应用价值。 关键词 海参，金属蛋白酶，丝氨酸蛋白酶，分离纯化，性质分析 PAGE PAGE IV Study of the collagenases from the body wall of sea cucumber Stichopus japonicus Abstract Sea cucumber belonging to the phylum Echinodermata of invertebrate is one of the important marine economic organisms because of its high nutritional and medical value. However, sea cucumbers are easy to go autolysis in response to a variety of environmental and mechanical factors. The autolysis of sea cucumber, resultin