海洋分枝杆菌中P450蛋白和人源TCF蛋白截短体的晶体学研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所 取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包 含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所 涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名： 杨焕 2015 年 5 月 21 日 非公开学位论文标注说明 (本页表中填写内容须打印) 根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申 请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本 说明为空白。 论文题目 申请密级 □限制(≤2 年) □秘密(≤10 年) □机密(≤20 年) 保密期限 20 年 月 日至 20 年 月 日 审批表编号 批准日期 20 年 月 日 南开大学学位评定委员会办公室盖章(有效) 注：限制★2 年(可少于 2 年);秘密★10 年(可少于 10 年);机密★20 年(可少于 20 年) 摘要 摘要 摘要 海洋分枝杆菌(Mycobacterium marinum)是一种非结核杆菌，主要感染鱼类， 当其感染了人类时，细菌会主要分布在皮肤上，很少有深入感染。海洋分枝杆 菌与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，简称 Mtb 或 TB)亲缘关系密切， 其氨基酸序列相似性高达 85%，广泛用作研究结核分枝杆菌致病性的模式细菌。 细胞色素 P450 是一种单加氧酶，广泛存在于从细菌到人类的各种生物体内，在 生命代谢过程中发挥着重要作用。结核分枝杆菌中含有 20 种 P450，其基因密度 远远高于其他生物，这说明 P450 蛋白在其致病性及抗药性功能中发挥着重要作 用。目前对 CYP126A3 和 CYP105Q4 的底物及功能方面的研究较少，经蛋白序 列比对发现两种蛋白与结核分枝杆菌中的两种 P450 蛋白分别有 39%和 33%的同 源性。我们希望通过对两种蛋白结构的研究推测其在海洋分枝杆菌中可能的功 能及其底物类型，进而为了解结核杆菌的致病性及抗药性机制提供一定的线索。 T 细胞因子（TCF）在经典 Wnt 信号通路中有着至关重要的作用，它能够招 募 β-catenin 与目的基因进行结合，进而调控下游目的基因的表达。近年来的研 究发现 TCF 蛋白中存在两个 DNA 结合结构域即 HMG DNA 结合结构域和 C-clamp 结构域。C-clamp 结构域在 TCF 蛋白与 DNA 的结合及对下游基因的激 活具有重要作用，特别是对一些较弱的 Wnt 反应元件（WREs）。而这些较弱的 WREs 通常对细胞的生长和细胞周期发挥着重要的调节作用。且 C-clamp 结构域 从果蝇到人体都很保守，这说明其在生物体基因调控中发挥着重要作用。 本论文利用结构生物学的手段和方法，对所研究的蛋白进行了克隆，表达， 纯化，结晶条件的尝试和数据的收集。通过 X 射线衍射技术，收集得到来源于 海洋分枝杆菌的 CYP126A3 蛋白一套分辨率为 1.75? 的数据。通过数据的分析 处理得知，该晶体一个不对称单位只有一个蛋白分子，溶剂含量为 52.1%，马修 斯常数为 2.57? 3Da-1。该晶体的晶胞参数为 a = 63.08，b = 105.84，c = 138.48?， α=β=γ=90o，属于 C222 或 C2221 空间群。正确的空间群必须在找到相位后才能 确定，目前结构解析工作在进一步进行中，相同来源的 CYP105Q4 蛋白的晶体 还在进一步优化中。对于人源 TCFt 蛋白，我们得到蛋白与 DNA 寡聚多核苷酸 的复合物，并得到初筛晶体，目前在进行下一步的相关工作。 I 关键词： 细胞色素 P450；CYP126A3；CYP105Q4；TCF；蛋白晶体 II Abst Abstract Abstract Mycobacterium marinum is a nontuberculous mycobacterium, which primarily infects fish. When human infections with M. marinum, the bacteria are usually localized on the skin. Less commonly it extends to deeper structures. M.marinum and Mycobacterium tuberculosis are closely related, as they have an average amino acid identity of 85%