果蝇Mre11蛋白精氨酸甲基化鉴定及在DNA损伤应答中的功能研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

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2019-04-12 发布于上海
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果蝇Mre11蛋白精氨酸甲基化鉴定及在DNA损伤应答中的功能研究-生物化学与分子生物学专业论文.docx

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大连医科大学硕士学位论文目录大连医科大学硕士学位论文目录一、摘要。1 (一)中文摘要 1 (二)英文摘要 3 二、正文．．5 1试剂。6 2果蝇株 8 3软件．．．．。9 4仪器。9 5引物 1 1 (三)方法。1 1 1果蝇Mrell蛋白序列与其它物种进行同源比对 11 2体外甲基化实验 1 1 3果蝇胚胎蛋白组分分离及定量 12 4甲基化位点检测 12 5应用siRNA敲低果蝇S2细胞中DARTl的表达．．12 6辐射处理动物 1 3 7突变果蝇模型建立．．1 3 8 DNA损伤敏感性实验 16 万方数据大连医科大学硕士学位论文9 大连医科大学硕士学位论文 9 1VVestem Blot ．．1 7 l O免疫共沉淀．1 7 11果蝇基因组DNA提取 18 1 2 DNA浓度测定 1 8 1 3基因组DNA电泳．1 9 1 4 Southern Blot 1 9 1 5单只果蝇PCR 20 1 6果蝇RNA提取。23 1 7反转录合成cDNA 24 1 8果蝇食物配置．24 1 9统计学分析．25 (四)结果。25 1果蝇Mrel 1的C末端具有GAR区域，该区域具有6个精氨酸位点 25 2果蝇MREll蛋白和MREll．C247被DARTl甲基化。25 3果蝇Mrell蛋白的亚细胞定位不均等．．26 4 MrellGAR区域的多个精氨酸位点发生甲基化．27 5敲低DARTl表达导致Mrell甲基化水平降低．28 6 Mrel 1与DARTl存在直接作用。28 7 Mrel 1与DARTl间作用不依赖GAR区域．29 8突变果蝇模型建立和检测．29 6 万方数据大连医科大学硕士学位论文9 大连医科大学硕士学位论文 9 Mrell精氨酸位点突变果蝇对电离辐射敏感．．33 (五)结论。33 (六)讨{念 34 (JC)参考文献．36 三、综述 39 (一)综述。39 (二)参考文献．45 四、致谢 49 万方数据大连医科大学硕士学位论文果蝇Mrel 大连医科大学硕士学位论文果蝇Mrel 1蛋白精氨酸甲基化鉴定及在DNA损伤应答中的功能研究 }葡要 MRN(MreI 1／Rad50／Nbsl)复合物在真核生物中高度保守，是DNA损伤应答中的主要修复复合物，在DNA损伤的识别、信号传导以及修复等过程中发挥重要的功能。Mrell蛋白是MRN复合物的核心成分，具有核酸酶的活性。它是DNA双链断裂修复过程的关键因子，可以对DNA断裂末端进行切割处理，从而修复DNA 损伤。当人类的mrelI基因发生突变时，导致共济失调性毛细血管扩张样紊乱综合症(Ataxia．Telangiectasia—Like Disorder,ATLD)。当小鼠ramll基因缺失时，导致小鼠胚胎死亡。而且，mrell基因在维持基因组的稳定性、DNA损伤后G2／M细胞周期检验点的激活及端粒稳定性等方面也发挥了很重要的作用。大量文献证明，翻译后修饰对于核酸结合蛋白的功能具有重要的调节作用。研究发现，哺乳动物的Mrell蛋白与蛋白质精氨酸甲基转移酶(ProteinArginine N—methylation Enzyme 1， PRMTl)相互作用，Mrell蛋白的C端具有一个甘氨酸．精氨酸富集区 (Glycine．Arginine rich domain，GAR)，此区域精氨酸被PRMTI催化发生甲基化修饰，并且这种修饰形式参与调节Mrell蛋白在DNA损伤应答中的各种功能。例如， mrell尺脒突变(精氨酸被赖氨酸替代)的小鼠胚胎成纤维细胞对伽马电离辐射高度敏感，辐射后细胞中畸形染色体增加，G2／M细胞周期检验点缺陷、ATR／CHKl 信号通路缺失，及RPA和RAD51的聚集减少。果蝇的Mrell高度保守，其缺失导致端粒融合及G2／M细胞周期检验点缺失。果蝇Mrell是否被PRMTl的同源基因DARTl甲基化，甲基化是否影响到DNA损伤应答功能，目前还不清楚。因此，实验室拟研究果蝇MreI 1精氨酸甲基化在DNA损伤应答中的功能。我们通过比对多物种间的Mrell蛋白序列，发现果蝇Mrell蛋白质的C端存在保守的GAR区域，具有6个精氨酸位点，分别为R559，R563，R565，R569，R571 和R579。通过体外甲基化实验证明Mrell蛋白质全长及Mrell-C247蛋白可以被 DARTl甲基化。应用位点特异性的甲基化抗体检测分析GAR区域存在4个甲基化精氨酸：R559，R563，R565和R569。将果蝇Mrell蛋白进行组分分离后检测，万方数据大连医科大学硕士学位论文发现甲基化的Mrell蛋白以核内可溶蛋白和染色质结合蛋白形式存在。用siRNA 大